1、精品文檔土壤淀粉酶產生菌的分離純化及相關性質測定摘要：為了了解土壤中微生物的種類和特征并從中分離出淀粉酶產生菌， 行純化和培養，并測定其產生的淀粉酶的活性以及對其進行生理生化試驗， 其代謝特征，需要進行一系列的實驗，并在此過程中掌握分離純化微生物、 物液體培養法、透明圈法測定淀粉酶活力以及生理生化試驗的操作方法和原理。 主要實驗過程如下：從土壤中篩選淀粉酶產生菌后進行復篩， 所得發酵液用于淀粉酶活力的測定以及生理生化反應。關鍵詞：土壤淀粉酶產生菌 分離純化 發酵培養 透明圈法 正文：1、土壤淀粉酶產生菌的分離與純化 1.1實驗原理在自然條件下，微生物常常在各種生態系統中群居雜聚。對其進 了解

2、微生接著進行種子培養,生理生化試驗為了研究某種微生精品文檔物的特性，或者大量培養和利用某一種微生物，必須事先從有關的生態環境中分 離出所需的菌株，獲得純培養。獲得純培養的方法稱為微生物的純種分離法， 也 即是從含有多種雜居在一起的微生物材料中，通過稀釋分離、劃線分離、單抱子 分離等方法，使它們分離成為單個個體并在固定培養基的固定地方繁殖成為單個 菌落，從單個菌落中挑選所需純種。不同微生物可用不同培養基和不同培養條件 進行單菌分離獲得純種，純種再經繁殖培養后，可用于進一步研究形態、生理等 欲從含有多種微生物的樣品中直接辨認出，并且取得某種所需微生物的個體進行 純培養，那是困難的。由于微生物可以形

3、成菌落，而每個單一菌落常常是由一種 個體繁殖而成。不同微生物的菌落是可以識別和加以鑒定的。 因此將樣品中不同 微生物個體在特定的培養基上培養出不同的單一菌落， 再從選定的某一所需菌落 中取樣，移植到新的培養基中去，就可以達到分離純種的目的。這就是純種分離 法的原理。在微生物的分離和純種培養過程中，必須使用無菌操作技術。所謂無菌操作, 就是在分離、接種、移植等各個操作環節中，必須保證在操作過程中杜絕外界環 境中的雜菌進入培養的容器。淀粉是有葡萄糖通過a -1,4糖苷鍵構成的直鏈淀粉和a -1,6位有分支的直鏈淀粉組成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分為a -淀粉酶、P -淀粉酶、葡萄糖淀

4、粉酶和異淀粉酶4大類。產淀粉酶的微生物有細菌、霉菌和酵 母等。利用淀粉遇碘變為藍色的特性，將分離的微生物接種在含有淀粉的固體培 養基表面進行培養，利用滴加碘液后菌落周圍出現透明圈，未水解的淀粉呈藍色,甚至有些微水解圈無色，判斷是否產生淀粉酶及初步判斷淀粉酶活力的高低。從微生物群體中經分離、生長，在平板上形成的肉眼可見的菌落，不一定是 單個細胞生長繁殖而成的，有的可能來自2個或者多個細胞。因此，純培養的確 定觀察菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征等綜合考慮。 生物的純培養要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。1.2實驗器材土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養基、淀粉培養基、PDA培養

5、基、99ml無菌水1瓶（帶玻璃珠）、5支9ml無菌水/試管等。1.2.1材料1.2.2用具棒、三角棒）無菌培養基、無菌吸管、無菌水、酒精燈、無菌涂布棒（又名擴散 、接種環、生物潔凈工作臺、生化培養箱、人工智能培養箱、手動 菌落計數器（SC6、移液器、移液槍、試管、三角瓶、顯微鏡等。1.3實驗過程1.3.1 土壤稀釋液的制備稱取土壤，制備稀釋度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀釋液。1.3.2稀釋平板法從土樣中分離真菌先在無菌培養皿中加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,再加入馬鈴薯培養基，充分混勻鋪平并凝固后倒置于 2830C恒溫培養56d,培養完成后觀察真菌

6、菌落形態。結果如圖1所示，培養基上分布有多個菌落，根據顏色判斷為有 兩種真菌，一種正面為青色，背面為肉色，有 9個菌落，另一種正面為墨綠色,背面為黑色，有霉味，有3個菌落。圖1稀釋平板法分離真菌結果1.3.3平板涂抹法分離土壤中的放線菌先在無菌培養皿中倒入適量淀粉培養基，鋪成平板，凝固后，再加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,用無菌三角玻棒在平板表面涂抹均勻，倒置于2830C條件下培養34d,觀察放線菌菌落形態。結果如圖2所示，并沒有分離得到單菌落，而只有菌苔，顏色為黃色，有泥腥味。沒有出現單菌落可能是操作 出現差錯，因為稀釋度為10-7，并沒有偏大，所以可能是操作的問題。圖2平板涂抹

7、法分離放線菌結果1.3.4平板劃線法分離土壤中的細菌先在無菌培養皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養基，制成平板，再用分區劃線法挑取稀釋度為10-2的土壤稀釋液一環在平板上劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于2830r培養。觀察細菌菌落形態，結果如圖3所示，有肉眼可見的單菌落, 直徑約為3mm顏色為肉色，有臭味。圖3平板劃線法分離細菌結果1.3.5用劃線分離法對淀粉酶產生菌進行分離純化1.3.5.1在分離出真菌的馬鈴薯培養基的平板上滴加碘液，如圖4所示，可以看 出僅有一個菌落的水解圈較大符合要求， 挑取該菌落，在淀粉培養基上進行劃線 分離，倒置30r培養。結果如圖5所示。圖4滴加碘液后的馬鈴薯培養基圖5淀粉培

8、養基上分離純化得到的真菌1.3.5.2 在分離出細菌的牛肉膏蛋白胨培養基上挑取單菌落，在淀粉培養基上進 行劃線分離，倒置30C培養，結果如圖6所示，有單菌落。圖6淀粉培養基上分離純化得到的細菌1.3.5.3 將淀粉培養基上分離純化得到的單菌落接種到斜面培養基上，培養至成 熟，待用。1.4結果與分析 1.4.1由圖1觀察可得真菌的菌落特征，本實驗中分離得到的為霉菌，有兩種,一種正面為青色，背面為肉色，另一種正面為墨綠色，背面為黑色，有霉味，菌 落較大且疏松，菌落比較干燥，用接種環挑取菌落時較難，說明與培養基結合牢 固。1.4.2由圖2觀察可得放線菌的菌落特征，本實驗中沒有得到單菌落，為菌苔,比較

9、干燥，顏色為黃色，菌落較小，分布緊密，帶有泥腥味。1.4.3由圖3觀察可得細菌的菌落特征，菌落小且突起，直徑約為3mm較濕,顏色為肉色，有臭味，用用接種環挑取單菌落時較容易，說明不與培養基結合。1.4.4由圖4觀察知有一個菌落的水解圈直徑較大，為淀粉酶產生菌。1.5結論 1.5.1對土壤中微生物進行分離篩選，觀察各種微生物的菌落形態，本次實驗結果如表1-1所示。含水狀態干燥較干燥較濕外觀形態大而疏松小而緊密小而突起菌落透明度不透明不透明稍透明菌落與培養基結合程度結合較牢固結合牢固不結合菌落顏色青色和墨綠色黃色肉色氣味霉味泥腥味臭味1.5.2在淀粉培養基上分離得到的單菌落，為淀粉酶產生菌，再接種

10、到斜面上進行培養，作為后續實驗的材料。2、淀粉酶產生菌的發酵培養 2.1實驗原理微生物發酵是生物工程的重要組成和基礎。它主要是利用微生物的特定性 狀，通過現代工程技術進行工業化生產有用物質的技術體系。微生物發酵既是開 發生物資源的關鍵技術，又是生物技術產業化的重要環節。根據微生物發酵方式的不同，可以將發酵分為固態發酵和液態發酵。 固態發 酵又稱固體發酵，是一種傳統的發酵方法，即將發酵的固體原料按一定的比例與定量水分混合后進行滅菌，然后接種菌種。液態發酵又稱為液體發酵，將所用原料配成液體狀態，接種菌種進行發酵。液態發酵又可分為淺盤發酵和液體深層 發酵。液體深層發酵采用密閉的發酵罐，在罐中進行發酵

11、。液體發酵大致分為三大工序：種子培養，發酵，提取。2.2實驗器材2.2.1菌種：大腸桿菌，枯草芽抱桿菌，前期實驗分離得到的菌種。2.2.2儀器：超凈工作臺、恒溫培養箱、搖床、發酵罐、發酵尾氣分析儀、移液器、接種環、酒精燈、記號筆等。2.2.3培養基：液體發酵培養基 2.3實驗過程 2.3.1搖瓶發酵30mL種子培養基231.1種子培養：取活化好的菌種由斜面培養基轉接入盛有的250mL錐形瓶內，與轉速180-220r/min旋轉式搖床上30C培養1-2天。2.3.1.2 發酵：吸取培養好的種子液3mL接入多個盛有30mL發酵培養基的的 錐形瓶內，于180-220r/min恒溫搖床上30C培養2-

12、3天。2.3.1.3 提取：取發酵液 20mL平均分配到兩個離心管中，12000r/min離心 10mi n,分別收取上清液和菌體，分別保存在冰箱中。2.3.2全自動發酵罐的基本了解全班同學分為兩批由老師介紹全自動發酵罐的基本構造和基本操作方法。2.4結果與分析本次實驗得到的上清液為黃色，菌體為淡黃色。保留，作為后續試驗淀粉酶 活性測定及微生物生理化反應的材料。3、淀粉酶的活性測定 3.1實驗原理淀粉酶包括幾種催化特點不同的成員，其中a淀粉酶隨機地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉漿的粘度下降,因此又稱為液化酶；伕淀粉酶每次從淀粉的非還原端切下一份子麥芽糖，又

13、被稱為糖化酶。產淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉為底物配置的固體培養基生長，其 菌落周圍的培養基會由白色變成灰色且透明，形成透明圈。在一定濃度范圍內, 透明圈的直徑d與淀粉酶活力的大小（對數值）成正比。以已知濃度的淀粉酶為 對照，制作透明圈與淀粉酶活力標準曲線。 從樣品的透明圈直徑大小可在標準曲 線上求得其淀粉酶活性大小。由于本方法是直接測定方法，而且靈敏度高，不需 要特殊設備，故被廣泛采用。3.2實驗器材 3.2.1菌種：產淀粉酶微生物 3.2.2培養基：培養基n：培養基I加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的瓊脂，透明圈測定使用。3.2.3儀器和其他用具：搖床、恒溫培養箱、紙片、移液槍、鑷子、淀粉

14、酶標準品、尺子、小試管、容量瓶、離心機。3.3實驗過程3.3.1 取取濃度為 1mg/mL 2mg/mL 3mg/mL 4mg/mL 5mg/mL 6mg/mL的淀粉標準溶液和樣品，滴于紙片上，使用6個培養基，每副培養皿放置4張紙片，置 于培養基的方式簡單表示如下:置放完成之后，在37 C恒溫培養箱中培養 18-20h 。3.3.2透明圈直徑的測定培養完成后取出，在培養基上滴加碘液，一段時間后，測定透明圈直徑（cm,結果如表3-1所示:表3-1標準淀粉酶溶液及樣品透明圈直徑（cm記錄表1mg/mL2.552.72mg/mL2.7533mg/mL33.054mg/mL3.23.35mg/mL3.

15、253.36mg/mL3.253.32樣品3.13.12.753.35樣品的透明圈直徑第3組實驗數據與前兩組相差較大（分別為2.6cm和2.55cm），故舍去。3.4結果與分析 3.4.1標準曲線表3-2標準淀粉酶溶液數據處理結果表測得的透明圈直徑取平均值，淀粉酶溶液濃度換算為酶活力，制得表3-2如下:序號透明圈直徑（cm淀粉酶活力（U/g）淀粉酶活力對數值12.62537003.56822.87574003.86933.025111004.04543.250148004.17053.275185004.26763.285222004.346根據數據處理結果作標準曲線，如圖1所示圖1標準曲線3

16、42樣品酶活力計算實驗測得樣品的透明圈直徑平均值為3.067cm,根據標準曲線所得線性方程y=0.916x-0.6487,計算得樣品的淀粉酶活力對數值為4.056,從而得出樣品的淀粉酶活力為11376.3U/g。3.5結論3.5.1繪制標準曲線得線性方程為y=0.916x-0.6487。3.5.2被測發酵液樣品的淀粉酶活力大小為11376.3U/g。4、淀粉酶產生菌的初步鑒定（生理生化試驗）4.1實驗原理細菌的代謝與呼吸主要取決于酶的催化作用，各種細菌具有不同的酶系組成，因此表現在對某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情況不同,代謝產物也有所不同，有些微生物能分泌淀粉酶將淀粉水解為麥芽糖或葡萄

17、糖;而另一些微生物分泌脂肪酶，將脂肪水解為甘油和脂肪酸。葡萄糖進入細胞后,不同細菌經不同途徑發酵葡萄糖，產生不同的代謝產物。這不但充分體現了細菌代謝類型的多樣性。同時，微生物對碳氮化合物的分解利用的生理生化反應也是微生物菌種鑒定的重要依據之一。4.1.1糖發酵實驗糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌的鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是他們在分解糖的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖并產生酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解 乳糖和葡萄糖產酸并產氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普

18、通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可用指示劑來顯示,在配制糖發酵培養基時，已預先加入溴甲酚紫（PH6.8以上時呈紫色，PH5.2以下時呈黃色）。當細菌發酵糖而產酸時，會使培養液由原來的紫色變為黃色。氣 體的產生可由糖發酵管中倒立的德漢氏小管中有無氣泡來指示。4.1.2 V.P試驗V.P試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力，如丙酮酸，丙酮酸進行縮合、脫羧后，產生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基起作用生成紅色化合物，此即為V.P陽性反應。當試管中加a-萘酚時可以促進反應的出現。4.1.

19、3甲基紅試驗 甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙 酸、乳酸等。在細菌代謝糖產生酸的過程時，培養基就會變酸，使加入培養基中 的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.2）轉變為紅色（PH4.4）,即甲基紅反應。4.2實驗器材 4.2.1菌種：大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期實驗分離得到的產淀粉酶菌株等。4.2.2培養基：糖發酵培養基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨培養基、胰蛋白胨水培養基。4.2.3 試劑：甲基紅試劑、40% KOH、5%a-萘酚等。4.3實驗過程 4.3.1糖發酵實驗分別接種大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期分離到的未知菌于糖發酵液體培養基（葡萄糖、乳糖）中，另一支不接種，37r培

20、養24h后，取出觀察是否有顏 色變化及是否有氣體產生。接種有大腸桿菌的培養液變成黃色，并且有氣體產生, 其他三支試管均無明顯現象。如圖4-1所示為葡萄糖發酵液體培養基的結果， 圖4-2為乳糖發酵液體培養基的結果。圖4-1葡萄糖發酵實驗結果圖圖4-2乳糖發酵實驗結果圖4.3.2 V.P 試驗分別接種大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期分離到的未知菌于葡萄糖蛋白胨 培養基中，另一支不接種，37C培養24h后，在三支菌管內加40% KOH20 滴, 再加等量的a-萘酚溶液，拔去硅膠塞，用力振蕩后于 37 C保溫30min，取出觀 察是否出現紅色。接種有枯草芽抱桿菌的培養液變成紅色，其他均無明顯現象。 如圖4-3所示為加入40% KOH和a -萘酚之前的結果。（由于在實驗過程中往接 有枯草芽抱桿菌的試管中加 a-萘酚時出現意外，打翻了一部分，但并沒有影響 到結果的觀察，但之后并沒有拍照，因此沒有實驗結果圖。）圖4-3 V.P試驗加入試劑之前的結果圖433甲基紅試驗分