1、流式細胞儀操作規程-SQP日期:流式細胞儀操作規程目錄1:淋巴細胞亞群測定及絕對計數2:活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的檢測3 :HL A -B 2 7 測定 4:C D 55/CD 5 9 測定5:干細胞檢測和絕對計數6:白血病免疫分型測定7:淋巴細胞T細胞亞群細胞內因子IFN- Y /I L-4 測定8細胞周期分析 9:活化血小板檢測 10:血小板抗體測定1 1:紅細胞抗體測定1 2:粒細胞抗體測定淋巴細胞亞群測定（流式細胞儀）醫院檢驗科操作規程文件號20 0 年 月 日起實施本規程每2年復審一次復審日期：年月日復審人：規程編寫者：審 批者：批準日期：年月日文件分發部門和/或個人院檔案室

2、保管者：檢驗科 主任:檢驗科實驗室:淋巴細胞亞群測定方法流式細胞儀（Bee kmanCoul t er貝克曼庫爾特）原理:雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中， 與白細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細 胞儀上進行分析，從而得到淋巴細胞亞群的百分數 ，加入F 1 ow-Co un t即可 得出絕對計數。淋巴細胞表面抗原分布如下:T淋巴細胞:CD3+; B淋巴細胞： C D3 -，CD I9+;輔助性T淋巴細胞：C D3 +CD4+抑制性T淋巴細胞：C D3+ CD8 +; NK細胞：C D3-CDI6 +5 6+等。根據淋巴細胞膜上

3、CD分子表達的 不同,流式細胞儀可以分辨出淋巴細胞及其各種不同的亞群，利用計算機軟件計算出淋巴細胞亞群的百分數，加入 F1 ow-Count組會自動得出絕對計數。標本采集與處理受檢者的準備采集部位抗凝劑要求檢查對象生活飲食處于日常狀態。 靜脈米血EDTA或肝素抗凝血1.樣本量1 ml。2.樣本應在米集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3.樣本白細胞計數應在9/ L ,0X 10 9/l,應分離單個核細胞。4.0-10.0 X 10 9/L 之間。若10.0 X 10樣本需要稀釋,用PBS稀釋；若V4 .試劑成分品牌 貝克曼庫爾特:單克隆抗體液體C D4 5 /4/8 /3 No.6607

4、013劑型規格貯存28CC D45/56/ 1 9 / 3N 0.6 607073C D4 /8/3 No. IM 1 650同型對照 I g G1/INo.lM167 2C D3/19 No.IM 1 2 93CD3/1 6 +5 6 NoM20 7 6No. I M26 43F 1 o w -Count 熒光微球 No.)2 :全血溶血試劑(Q- Pre p)液體(No.7546 9 46 )A :甲酸B :碳酸鈉等C:多聚甲醛(O ptily s e C No.IM 1液體 70液體液體4 01） 液體ML32M L1 4MLG1/ IgGICD19-PC5室溫室溫室溫室溫:鞘液(No.

5、 8 546 8 59)液體2 0L室溫4:清洗液(No. 8 54693 0 )液體5 L室溫5:熒光微球(N 0 .66053 5 9)液體10M L2-8 r(F l3C heck)0 w-儀器Be C km anCoul t e r EPI CS X L/FC5 0 0 / Al t ra10/ 2 0 ul單克隆抗體和同型對樣本制備:1 ）按照要求，分別向已編好號的試管中加入 昭2）分別向試管中加入混勻的10 0u 1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4） 溶血:a.OptiL y se C （按說明書步驟溶血）b .使用C OULT陂 Q PREP制備系統開機顯示REA

6、 DY燈亮-選擇35SEC燈亮- 開門 放入試管關門 -自動進行溶血-顯示 REA DY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個 樣品測定。（*溶血前確認A /B/C管路充滿并能打出液體）5）上機測樣（可根據樣本情況選擇洗或不洗上樣）6）需要做絕對計數的指標，在相應管中加入與血樣等量的Flo W Count （務必做到三同：同槍，同人，同種方法加F Io W -C 0 unt,而且加完即上機）報告結果報告百分數（和絕對值）操作性能精密度批內五次重復CV<2參考值（百分數（絕對值）CD3+ 60. 8 -75.4%( 1 141- 1 880) CD4+ 29. 4-4 5 . 8 %(47 8

7、-1072)NK 9.5-23.5%(17 5C D8+18 .2- 3 2.8 % ( 3 93- 7 42)56 7 )Th/Ts 1.05-2 . 03臨床意義1. T、B淋巴細胞亞群是重要的免疫狀態檢測指標 ，在腫瘤、免疫缺陷、病毒 感染，自身免疫性疾病、創傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具 有臨床診斷、病情判斷、治療等價值。臨床常用Th/T S比值來判斷病人的免疫狀況。Th/T S比值升高:表示免疫功能亢進：見于自身免疫性疾病,如SLE、類風濕 性關節炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及HBsAg +乙肝等。Th /Ts比值減低:表示免疫功能下降:艾滋病、病毒感染、腫瘤病

8、人、慢活肝 和活動性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細胞減少患者。2: NK細胞主要破壞各種腫瘤細胞和感染某些病毒、細菌的細胞，所以在抗腫瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫瘤、 自身免疫性疾病、 病毒感染、應用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長而減退。NK細胞也參與第二型超敏反應和移植物抗宿反應 ，白介素-2治療后；外周血NK 細胞增加。-M I* .一 口廠三 771?=1 urg a J， - I:1 卜了 “ |L”Gu勺u I*- (l-TZ| lHw Jga :上ISJmdlto-r -UilCfc* -B<I.OPrA*'!?I卯r

9、71;i 4 ji_BI亦中S*H ITr>±FM 業 01心hiLeiwiWMnj亦|_|bwdPi Pi irpinFl皿Nkujo|iu w FQCipirALfbkv hnr:. DiJcti b113 jj M 3iVi gtarisll t-prafex，I35uI E IW B Qd5p>rii也£ AI iwu* 廠 OkXkPI ":炸+£11屈-I i_Vfrr,AlP .ffC日二g需A黑屮lilC'T-；阿IHm Mlfc _(ibmuDm越nxi mi瑁 QCMiVUte jJVBll 日鼻 fl|unjwi

10、hi Jkf BC-lviT'' IWrg*Ktpih II畫Ejy viQta-片kwT廠L 口*応OmPE«*I71wX：ISllHT««>Wj斑護過Sfdi« 1* 戸廠請丨nr日蚌r!j?i0F3imCfFfTPEoprKfith*CE#Fc+rbwn'fdi*/I J'*»"“； I:fair 、nin-1EU點八'、IIIP'訃|F5 Lt 忙il H 打科hiF呈.丹i； hn1/ HiL UL Gdti J* LX %hl"fS-ILn31 Ln g* P

11、t LegEG?!ii PCLdt FW：UrnPLn呂芻InFire L四PEUURCS朗FT|£tJHrt1 GLn-y_ r*M. r|w13rUirndtan |p=.LflJ廠任DdhCCrinSu 閑 srRDefjedPAhieiaarrn“>Irv1r=1廠rJCnd 1HKtt4UHL4t«9fU 101 TTTwq «. IfI»tsHfu btrfUUB*nctu;Gi'#C5«*!»*結果1u1 了g =暑裁:-n七卄hllUJ 1"'-II.'f乩,Ji in 三 3i

12、h H：-J2 ij*n I141C'” I r iyi罰:3E -_ -.F_=.=- = . -=；- .-J .1訊:" -.驀 嚴;- 補.=1-sf.-.川_. HFJ弋 < .訂巧B= . =- .沁_；_ : . .；.1 1' b d ! H強» 1 Hi IIp1|l rp |： I I ' n .i|/：和*A -J-'-J<： ；-.：- - <38nK _ : Rte>ielUMTT討此圖為CD45圈門Rs一 n、二。圧擔a C_i OI- X茁從二亠I型 H曲墾-爭蘭加円.P昭二盤ME JI

13、-:三里JT旦J H子-一二皿Eganu- - J Jr & &二UC3C蚤 rAEn LiU-H *us 二生匕一仏尼山US )E 二：flw專 "Fs-fiu w¥ Tf -s Ja" at-3s-5dgM3電刊 h*SN笆gyt*oyn X鳥IT.3-3* Q-i J1* 口- S4 : 3 翼盒一 _£ 1 丄 i S Jd一 倉活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的測定方法流式細胞儀（B eckmanC oulter貝克曼庫爾特）原理:雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白 細胞膜上相應的抗原結合，經過

14、溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀 上進行分析，從而得到相應各亞群的百分數。活化淋巴細胞表面抗原為 CD3 +/CD25+和 CD 3+/HL A-DR+ C D3 +/ C D4 5R O+是記憶型 T細胞。CD 3+/CD4 5RA +是純真型T細胞。標本采集與處理受檢者的準備 采集部位抗凝劑要求檢查對象生活飲食處于日常狀態。靜脈米血E DTA或肝素抗凝血1. 樣本量1ml。2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在4. 0 10. 0X 1 0 9/ L之間。若>10.0X 10/L ,樣本需要稀釋，用P BS稀釋;若<4.0

15、X 10°/ L ,應分離單個核細胞。試劑品牌貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體（C D3/ HLA- DR劑型規格 貯存(Opt液體No . IM 1295CD3- FI T C No. I Ml 281 CD45RO-P E No. I M130 72:全血溶血試劑(Q-PreA:甲酸B :碳酸鈉等 C:多聚甲醛i lyse C No.IM1 4 0 l3:鞘液(No. 854 68 5 9 ) :清洗液(No. 8 54 6 9 30) 熒光微球(No.6605359)液體2 8CC D 25-P C5No. I M2646C D45RA-PENO.IM18 3 4CD4-PC5

16、No.I M26 3 6 ) 液體(No. 7 546 9 46) 液體液體液體液體液體液體 5L7 0ML32ML14 ML室溫室溫室溫室溫20 L10 ML 2-8 C (Flo室溫室溫w Check)45:儀器BeckmanCoul t e r EPI C S XL/F C 5 0 0/A Itr a樣本制備:1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/ 2 0 ul單克隆抗體和同型對昭2）分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育2 0 - 3 0分鐘4）溶血：a . Opt 1 Ly se C （按說明書步驟溶血）b.使用COULTERS P REP制備系統開

17、機-顯示READ燈亮-選擇35SECT亮-開門 -放入試管關門 自動進行溶血 顯示RE ADY 燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測 定。（*溶血前確認A/ B/C管路充滿并能打出液體）5）上機測樣（可根據樣本情況選擇洗或不洗上樣）報告結果報告百分數操作性能精密度批內五次重復CVk 2%參考值（百分數）CD3+ / HLA-DR+3.1 ± 1.3 %C D3+ /CD25+ 1 5.9 ± 3.7%CD 3 + / C D4 5 RC+ 3. 3± 1.55 %C D3+/CD45R +/CD4 +20. 51 ± 3. 6 4 %臨床意義1. H

18、L A-DR、CD2 5、CD 69是T細胞活化各個時期表達的標志性抗原，對其進行檢 測可以判斷出疾病的進程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預后和治療。如活化狀態的監 測是對機體移植免疫狀況判斷的最主要依據，有助于臨床選擇治療方案,CD 2 5 + /CD3+ >5-10%提示排斥、持續增加提示應作病理活檢；CD3 + /HLA-DR+增加5- 10 %但不伴C D 25增加提示M C V感染。2 .正常機體內各種 T細胞之間以及與其他免疫細胞之間在數量上保持一定比例，如果它們之間比例失調就會引起免疫功能紊亂，將導致機體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發生，檢測淋巴細胞各種亞

19、群有助于疾病的診斷、預后和治療。CD 4 5 RA、CD4 5RO均為T細胞的輔助分子,CD4 5RA +純真型T細胞當免疫力 下降時減少；CD45RO +記憶型T細胞對第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾 病中增加，在慢性感染疾病中減少。方案(P r oto co 1 )同淋巴細胞亞群檢測結果(Re sul t)方法HLA- B27測定流式細胞儀（B e ckmanCo ult e r,貝克曼庫爾特）原理:雙色直接免疫熒光法。將 HLA- B 2 7 -FI T C/ HL A-B 7-PE單克隆抗體加入 到全血中，與白細胞膜上相應的抗體結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后, 在流式細

20、胞儀上進行分析,測定HLA- B7陰性而HL A- B2 7陽性細胞的平均熒 光強度和所占的百分比。標本采集與處理受檢者的準備 米集部位 抗凝劑要求12.檢查對象生活飲食處于日常狀態。靜脈米血E DTA或肝素抗凝血.樣本量1m l。樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3.樣本白細胞計數應在4.0-10 . 0X 109/ L之間。若 1 0 .0 Xl 09/ L ,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4 .0 XI 09/ L,應分離單個核細胞。4 .溶血樣本不能用。試劑品牌貝克曼庫爾特 成分 1:單克隆抗體劑型規格貯存1ML（HLA-B 2 7/HLA- B7No. I M150 2

21、o. I Ml 38 9 ）2:全血溶血試劑A:甲酸B:碳酸鈉等C :多聚甲醛3:鞘液4 :清洗液5:熒光微球液體2 8C同型對照IgGI/1 g G2 a N液體液體 液體 液體液體液體液體70M L 32ML14 ML20L5L10ML室溫室溫室溫室溫室溫2-8 C質控品 B EKM ANO ULTER產品,未開瓶的試劑于2- 8C保存，可在有效 期內保持穩定，稀釋的試劑于2- 8 C可穩定2周；每天校準一次：遇 特殊情況隨時進行校準。儀器B eckmanCo ul terEP ICS XL/FC500/A1 t r a樣本制備：1 ）按照要求，分別向已編好號的試管中加入 20 ul單克隆

22、抗體和同型對照（Ig G2a- F IT C/ I gGl PE）2）分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3）混勻,避光,室溫孵育20-3 0分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b .使用COUtL E R Q PR EP制備系統開機-顯示READ Y燈亮-選擇35 S EC燈亮- 開門-放入試管關門-自動進行溶血 顯示R E ADY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣 品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5）洗、離心、上機測樣（備注：測B2 7一定要至少洗一遍方可上機檢測）報告結果報告陰陽性操作性能精密度批內五次重復CV<2 %參考值陽性:

23、H L A-B2 7陽性而HLA-B7陰性細胞的平均熒光強度在 5.0以上, 陽性率>9 0%。臨床意義HLA復合體位于第6號染色體的短臂上,該區DNA片段長度約30 0 0-4000 K B, 占人體整個基因的1 /3 0 00,HLA-B27是HLA-I類基因中B位點上的一個等位 基因，與多種疾病具有相關性，尤其是強直性脊柱炎。HL A-B2 7基因屬于？ 型MH（基因,所有有核細胞上均有表達，尤其是淋巴細胞表面含量豐富，人們發 現HLA -B27抗原表達與強直性脊柱炎有高度的相關性,超過90%勺強直性脊 柱炎患者HLA-B27抗原表達陽性，而正常人群中僅 5-10%勺認為陽性。由于

24、強 直性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此H LA- B27檢測在 疾病的診斷中具有重要意義，H LA-B27的檢測是該疾病診斷和鑒別診斷中的 一個重要指標。SI刃目J 鼻f二念 i； £二二-_空一瞰 a肯-Lro pv? 一-£7*JnxYH EG 工 MrF 丄r t4P.JCF»T b;ll制丄WIT 二牡=_rm 丄 莒一二u片】旻 當方Tt 電tp-5L-s 尋 T -YMWBSf _lsTP4e- 血韋昂£j甫M3SU a丟小匸二寺心£IBS CKr- J" 匚Jcfil(a 1 TPE-nBgom a&q

25、uot;h1atQo-QrQU r" J丄I2:ruv 冒I"£ LlgLnu_一brnLE -HIT MIS Ksrzlp, 二上=lrMMLUJr .工一t 5>-s ¥ ¥£ 占； -YtMlE."i- 2畫rsi g_【 -占PT-_【Kid 電 7 AP盤nsdufis二-e?占一翼一 ：_ 一 S 0 m 一 ；.屈 n f SI” T .: :空一 .Ti»* J H - « D 苦 i 電富亠訂 s&TIf 吸2 餐電一 $ 二山 *g報曲理L(_8 04 0 Id)nvir

26、:11blRlMH Ir«KtFM*I， r r QgcoMp(ekvOiwn m二上八咔IIII173, 11 EFrsrrFL1fUrrfDrd2rrrrppu 3 F*Mk>tVvvwtlW«r(V"gT d|Sn rMttVsJu«d*wt tufaII K |u«U W T r； :0QI0C«>*n<w»|專5唇II I III AC< I Mnftttt I CdnrcMM*)U；-日32|汪更；I rt H F ®' » H I習I II V d J

27、71;b <fbt*. _J >»Dmkivi從“ -ITSc* n R*«Plbryv JfSL*FS|> 11 UiFffCU« «LwUQ廣阿pr» 一 Dg 祕 PVcn r»*»WiaMwh<ieor«r *«uJ <aOxmwftt IOvudnriMr3zlrJMorg.wwtt IM*>到ror«wS3«>:”Ee09 依 5坊E： (CICD0UlOB «T EC*¥ CR «PEUuPhI rf

28、vw葉網Zanim"*«|55Q,"s $35 nrctof PE LeoOt I Cihcri jNtt rvrrg 4 gSiaM戶"“BEr蟻* r (wd8M r b>9mzqzI'anj 葉MHjm Ik III : Pl r u ?i r o I * I. 31 b 1 古口門引吹£)01血昭馬込+鬥g心FNFU 丁ngSwipM Jixbef AHJC»>O4wj.rf：I旳冒J刃FHiS：«*hFS 心阿 gl亂別vwa 四Mme匹出mn3 H 盼|占曲3| n |4J < 

29、3;JdI- u TCXft2SiJfiiZ1SiwhiH 丹附 HrAfli bVr-?*.! y p. r |HUlJdL 闔rt n5処FOE |F5 Ln L nmEf.恤 LnSltelJSr*rHetFEW 弱Lr.Fl心 rt LbjJ|hEiacdl=|-pD|zr«l«-tJirQ fl 舊LHinti(M 辰“ T PI ' I' -i"i砒0HIABir rncA Pli icilB J零-I 咄3話FE鍵入文件名，點擊Save2.畫圖M bn圖氣FL零IeTWJ-ff rLvI ":卜，I I話抽恥H序a B爭二

30、I lA-rFiRKEJ廠申 I Ql>CCIHF r E«!?*Qri 瑕pff山二 '阿SJf 亠VflTT|iDWP町祁詢岬M別；：斗4勺畑I口IT甸出1 BimM妙I-MygZF匚一f -.n 卜 H V Pi c u 3pwWWW ISgz 1=J“HH r Fb7ik«?阿FTIIHkhETT HhC訂ICD5 5/CD59測定方法流式細胞儀（Beckm anCoul te r，貝克曼庫爾特）原理:雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明,紅細胞和白細胞膜上CD 55和C D5 9分子的表達量和缺乏表達細胞的數量對P NH診斷和鑒別有重要意義。血細 胞（

31、紅細胞和白細胞）通過膜上的抗原分子與熒光素標記的 CD55或 C D59的多 克隆抗體結合。用流式細胞儀檢測 CD55或 CD59表達陽性細胞百分數。標本采集與處理受檢者的準備 米集部位抗凝劑要求檢查對象生活飲食處于日常狀態。 靜脈米血EDTA或肝素抗凝血1 .樣本量1ml。2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3. 溶血樣本不能用。試劑品牌貝克曼庫爾特成分1 :單克隆抗體9 -FI TC NO.IM3457:全血溶血試劑A :甲酸(CD523:45:劑型液體CD液體液體規格貯存1ML5 5- PE2 8CN0.IM2 7 26)室溫 室溫14ML室溫70MLB:碳酸鈉等液體 3

32、2MLC :多聚甲醛 液體 鞘液液體 20L:清洗液液體 5 L室溫熒光微球液體10M L室溫2- 8C質控品BEK AM AN COULT ER產品，未開瓶的試劑于2-8 C保存,可在有效期 內保持穩定，稀釋的試劑于2-8 C可穩定2周;每天校準一次：遇特殊 情況隨時進行校準。儀器Bee k manCb ul te r E PICS XL/FC5 00/Alt r a樣本制備:（一）白細胞CD 55/CD59檢測10 Oul。1. 準備2支流式細胞儀專用管，分別標記。分別向二管中加入樣品2 .溶血：a . Opti L ys e C （按說明書步驟溶血）b. 使用COULTERS P RE

33、P制備系統開機顯示READ"燈亮 選擇35SEC燈亮- 開門 放入試管關門-自動進行溶血-顯示READZ燈亮-開門取出試管-再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A /B/C管路充滿并能打出液體）3 .離心后分別加入CD55/CD 59 10ul和相應的同型對照10 ul。避光2 0-3 0分鐘。4. 洗滌離心5. 上機測樣（二）紅細胞CD5”CD59檢測1 .準備2支流式細胞儀專用管，分別標記2. 分別加入CD55/CD59 10ul和相應的同型對照10ul。3. 向二管中加入1:200稀釋的樣品100 ul （可根據紅細胞的數量調整）,避光20 -30分鐘。4. 洗滌離心。5. 混

34、勻、上機測樣。報告結果報告百分數操作性能精密度批內五次重復CV<2%CD55>97%PNH 的臨界值：RBC C D59>9 5 %PNH 的診斷值：RBC CD59>9 1%參考值C D5 9>9 7% WBC C55 9>90% 大部分>80%中性粒細胞CD 59 > 84%臨床意義用于AA和PN H的診斷和分型診斷。PN H時CD55和C D59明顯減低和缺如。方案(Protoc o l)(同 HLA-B 2 7 )n沖蟲LInflSL r.tcFfl?qtrCOtnTCcm FncouocosK.1<orf i初f riffU巾島?

35、 二匸一二一7JLI,5業I,二-& iwouqeocoff3 * Wl-二一-i j -nltm許一 右L V -= - - B - r -£iHI ri ur 11 .亠唄I 2ir-131勺Ir12-|i r3.WBC":I.-=ij -_ _ <J.64 I rflllI I ti I III I ICTI M I llilliiI I* J _pHI干細胞 檢測和絕對計數方法流式細胞儀(B eckma nCoulter,貝克曼庫爾特)原理:雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中 ，與干細胞 膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌(和固

36、定)等步驟后,在流式細胞儀上進 行分析，從而得到百分數，加入Fl o w-Count即可得出絕對計數。標本采集與處理受檢者的準備采集部位抗凝劑要求2.檢查對象生活飲食處于日常狀態。靜脈米血EDTA或肝素抗凝血1 .樣本量1ml。樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。 .樣本白細胞計數應在 4.0- 1 0. 0X 109/L之間。若> 10.0 X 109/L,樣本需要稀釋，用PB S稀釋;若<4. 0X1 09/L,應分離單個核細胞。試劑成分品牌貝克曼庫爾特1:單克隆抗體(C D 34 No. I M1871Fl o w-Count熒光微球劑型規格貯存液體2 8CC

37、D4 5-PC5 No.IM 2 653/1 M2652 No.)2:全血溶血試劑(Q-Pr e p )A :甲酸B:碳酸鈉等C:多聚甲醛(Opt i ly se C No.lM1403:鞘液(No. 85 4 6859 ):清洗液(No. 85 4 69 3 0)5 :熒光微球(No.66053 5 9)液體 1液體(No. 75 46 9 46)液體液體3液體1)液體液體2液體 5L0 ML70ML2ML142-8室溫室溫室溫室溫室溫室溫C (Flow-Check)ML儀器B e ckman Coult er EP ICS X L /FC50 0 /A 1 tra樣本制備：u1單克隆抗體和

38、同型對照1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入102）分別向試管中加入混勻的100 u1抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4 ）溶血:a. O pt iL yse C （按說明書步驟溶血）b.使用COULTERPR圧制備系統 開機-顯示READY!亮-選擇3 5SEC燈亮-開 門放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣 品測定。5）需要做絕對計數時 三同：同槍，同人,6 ）上機測樣報告結果（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）,在相應管中加入與血樣等量的F 1 ow-Count（務必做到同種方法加 F 1 ow-Co unt,而且加完

39、即上機）報告百分數（和絕對值）操作性能精密度批內五次重復CV<2%參考值（百分數（絕對值）CD4 +/ CD4 5 +0.58 ±0. 29%臨床意義目前把CD3 4作為造血干細胞的主要標志，CD3 4陽性細胞計數作為造 血干細胞水平定量的檢測方法。- -Lp l|f Mil LircBd kin列5n. I'Kir I i-fl*H-I.方案(P r o toco l )同淋巴細胞亞群檢測纟吉果(R esult)e-Jff£BLUM白血病免疫分型測定方法流式細胞儀(BeckmanCou lte r,貝克曼庫爾特)原理:雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克

40、隆抗體加入到全血中 ，與細胞膜 上或膜內相應的抗原結合，經過溶血、洗滌(和固定)等步驟后，在流式細胞儀 上進行分析，從而得到百分數。標本采集與處理受檢者的準備 采集部位 抗凝劑要求 1.檢查對象生活飲食處于日常狀態。骨髓采血EDTA或肝素抗凝樣本量1ml。2 .樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3 .樣本白細胞計數應在 4.0 -1 0. 0X 10'/L之間。 若1 0 .0 X 10 9/L,樣本需要稀釋,用PBS稀釋;若V4. 0X 1 0 9/L ,應分離單個核細胞。試劑成分2:品牌貝克曼庫爾特1:單克隆抗體(CD34 No. IM 1 871F 1 ow-C

41、o u n t熒光微球 全血溶血試劑(Q-Prep)A:甲酸B:碳酸鈉等C :多聚甲醛(Opt i I y s e C劑型規格貯存液體2 8CC D45- P C5 No . I M2653/IM2652 No.7 5 4 7 05 3) 液體(No.7 5 4 694 6 )液體 7 0 ML液體 32 ML液體I M14 01)N 0.14ML液體室溫室溫室溫:鞘液(No.8 5 4 6859)4:清洗液(No. 8 54693 0 ) 熒光微球(No .660 5 359) -Check)液體液體液體20L5L0 ML室溫室溫2 -8 C (Flo W315:儀器BeckmanCoU t

42、 er EPIC S XL/FC50 0/A 1 t ra操作-樣本制備：細胞膜表面抗原1 .首先準備所需的管，并在管上標記上欲加入的抗體。2.首先每管中加入5u l C D45-P C5抗體。3 然后，按管上的標記，加入相應抗體各10u l（注意：必須是FITC和PE標記的抗體搭配）4 .各管中加入標本（骨髓或外周血）3 01 0 0u1（根據細胞的多少決定），振i Lys e C （按說明書步驟溶血） 使用C OU LT ER Q P RE P制備系統開機-顯示READY!亮-選擇3 5 SE C燈亮-開 門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣

43、品測定。（*溶血前確認A / B / C管路充滿并能打出液體）蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5 .溶血：a. Optb.細胞漿和核抗原并在管上標記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。1. 準備所需的管，2. 首先每管中加入標本（骨髓或外周血）10 0 u 1 （根據細胞的多少決定），5 UICD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3 .每管中加入固定液100u l，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4.各管中加入PB S4ml。5.300 g離心5分鐘后，棄去上清液,振蕩混勻。（1 50 0 r/m in* 5min）6各管中加入透膜劑1 00ul,輕輕混勻，室溫避光5分鐘。7. 加抗體，陰性對

44、照管中加入1 0 u 1，其余各管加入相應抗體各10ul，室溫 避光15分鐘。8. 各管中加入4 m lPBS,振蕩混勻。9. 300g離心5分鐘后，棄去上清液。10. 各管中加入PB S500 ul，振蕩混勻。11 .上機測樣報告結果報告百分數操作性能精密度批內五次重復CV <2%參考值CD 3 4+<5%MPO +v5 %粒系V 20%淋系30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案(Pr 0t ocol )T細胞亞群細胞內因子I FN Y /IL-4檢測方法流式細胞儀（Bee kmanC oulter貝克曼庫爾特）原理:直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在 PMA, Ion o

45、mycin和Mon ens i n存在 下短期培養（輔助性T細胞通過細胞因子IF N- 丫、IL-4的產生分為Thl、 Th 2兩個亞群。淋巴細胞活化以后才分泌細胞因子，且迅速分泌到細胞外。因 此，利用刺激劑PMA+Ionmy e in體外激活淋巴細胞，然后用蛋白轉運抑制劑 Monensin阻止細胞因子分泌到細胞外，使細胞因子在細胞內滯留到一定的 量），然后進行細胞膜表面抗原和細胞內細胞因子染色，使用流式細胞儀對CD標本采集與處理受檢者的準備 采集部位 抗凝劑 要求4 +細胞內的I F NY和I L -4進行測定。檢查對象生活飲食處于日常狀態。靜脈米血 肝素抗凝血1. 樣本量至少1ml。2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。.樣本白細胞計數應在 4.0 10.0 XI O9/L之間。若10.0 X 1 O9/ L,樣本需要稀釋,用PBS稀釋;若4.0 X 1 0 9/L,應分離單個核細胞。4.溶血樣本不能用。3試劑164 0 液。淋巴細胞培養體系(自配) 成分：刺激素P MA、離子霉素、莫