1、臨床細菌檢驗的質量保證臨床細菌學檢驗在檢驗醫學中具有特殊的位置， 主要表現在它的高風險性 （如腦脊液培養結果正確與否直接關系到患者的生死） 、高干擾性（如標本采 集、運送等過程中的諸多因素都會干擾檢出率和正確率） 、高技術性和高嚴謹 性（準確表達、報告和解釋結果直接影響治療的成敗） 。因此，細菌培養和藥 敏試驗等屬于高度復雜的試驗范疇。由于致病菌的多樣性和變異性， 臨床細菌學始終是一門知識更新和發展較 快的學科。 為此，從事臨床細菌檢驗的醫師和技師必須具有較好的業務素質和 敬業精神，要勤于學習和探索，要有嚴謹求實的作風和對新事物的敏感性，這 是高質量完成細菌檢驗任務的首要條件。細菌檢驗的質量保

2、證是一個連續的質量管理系統，包括從患者準備，申請 單書寫，標本采集、標識、保存、運送、處理和檢驗，結果分析和報告，直至 醫師的理解和應用（診治） 。為了對這一過程的質量進行管理，本規范從檢驗 前、檢驗中和檢驗后三個方面提出相關要求。一、 檢驗前的質量管理（一）檢驗項目的申請細菌檢驗項目的申請要有針對性和合理性。 臨床醫師應在熟悉人體各部位 正常菌群以及常見致病菌的基礎上，結合感染患者的癥狀、體征，科學地提出 檢驗申請。對于有感染跡象者（ WBC 增高，中性粒細胞升高， CRP>20mg/L 等），應盡快申請做細菌培養與藥敏試驗，并力爭在使用抗菌藥物之前送檢標 本，以便及時獲得致病菌的有關

3、資料和藥敏結果，正確選用抗菌藥。對于低臨 床價值的細菌標本，如口腔和腸內容物、直腸周圍膿腫、褥瘡、多毛的膿腫、 惡露、嘔吐物、 Foley 導管尖等，由于易受正常菌群的污染，細菌培養價值較 低，一般不做細菌培養；必須申請細菌培養時，其結果應結合臨床分析。由于 細菌檢驗的特殊性， 細菌檢驗申請單必須提供臨床信息， 特別應說明患者是否 使用過抗菌藥以及使用過何種抗菌藥， 以便于實驗室有的放矢地抵消抗菌藥的 作用，提高細菌培養陽性率。（二）檢驗標本的采集、保存、運送和驗收1 患者的準備 主要包括兩個方面： 一是做好采集部位的清潔和消毒工 作，防止正常菌群的污染；二是耐心細致地交待患者，使其主動配合以

4、便 采集到有價值的標本。2 標本采集 標本正確采集十分重要，其目的是千方百計捕捉病原菌并 保持其活性，以提高檢出率， 同時又要盡可能避免非病原菌的污染和干擾。 為此， 要根據各種感染性疾病和目標病原菌的不同特點， 正確合理地確定 采樣部位、時機和次數。要選用恰當的采樣器材嚴格按規范操作。一般來 講，采樣量多一些有利于病原菌的檢出，但應以不影響患者健康和便于操 作為前提，因此采樣量要恰當。3標本保存與送檢 盛標本的容器應無菌、 不漏和便于密封。 要根據目標病原菌的特點決定是否使用保菌液、運送液或增菌液，以及選擇何種保菌 液、運送液或增菌液。標本采集后應盡可能立即送檢。如不能及時送檢， 要根據目標

5、病原菌的特點確定保存條件 （如溫度等），在規定的時間內送到 實驗室。4驗收和登記 標本的驗收和登記要有專人負責。驗收的內容主要包括： 采樣時間與送檢時間（的間距）以及送檢條件是否符合保存致病菌活力的 要求；盛標本容器是否有溢漏和污染；申請單是否填寫完整；標本標識是 否與申請單一致和唯一等。對不合格的標本要拒收，并向送檢醫護人員說 明拒收原因，告知正確送檢的要求，囑其重新采集和送檢標本。以上各項均與細菌檢驗的質量密切相關，檢驗科（細菌室）應與臨床科 室通過共同研討，認真制定有關的要求和標準操作程序，并嚴格執行。檢驗中質量管理（一）致病菌分離鑒定1. 標本（細菌）的接種、分離和鑒定根據標本和檢驗目

6、的的不同接種不同 的培養基。對陽性培養要分離純化，然后進行分群和種屬鑒定。整個操作 過程要按標準操作程序（SOP）進行，不得隨意更改操作程序，對于疑難菌 株，要查閱文獻、組織會診，不能草率作出結論。2. 檢驗過程的記錄和結果報告 檢驗過程中所見現象和發現的問題，均應如 實地記錄，以便于分析實驗結果，作出正確結論和發出可信的報告，亦可 作為今后總結和改進工作的依據。所發報告內容要登記，以便查詢；如原（初步）報告有誤或不完善，應發糾正報告。（二）藥敏試驗質控藥敏試驗應嚴格按NCCLS規定的培養基、操作方法、藥敏紙片和判定標 準進行。為了監控試驗過程的質量，必須做好藥敏質控。1常用的藥敏質控標準菌株

7、NCCLS從美國菌種收集中心（ATCC）選擇推薦了一些菌株作為質控標準 株（見表1）。表1常用藥敏質控標準株標準菌株名稱ATCC編號用途大腸埃希菌25922用于常規紙片法藥敏質金黃色葡萄球菌25923控銅綠假單胞菌27853大腸埃布困35218產B 內酰胺酶，用于含肺炎克雷伯困700603B 內酰胺酶抑制物的 復方制劑的質控和ESBLs的檢測質控流感嗜血桿菌49247、 49766和 10211用于嗜血桿菌的藥敏質 控淋病奈瑟菌49226用于淋病奈瑟菌的藥敏 質控糞腸球菌29212 和 33186用于磺胺類和TMP的藥敏質控金黃色葡萄球菌29213用于MIC測定的質控以替換25923肺炎鏈球菌

8、49619用于肺炎鏈球菌的藥敏質控幽門螺桿菌43504用于HP的MIC質控脆弱擬桿菌 多形擬桿菌 產氣夾膜梭困 遲緩真桿菌25285297411312443055用于厭氧菌的藥敏質控2質控株的保存 盡管質控標準株比其他一些菌株藥敏結果是相對穩 定的，但反復多次的傳代不可避免地會造成菌株的變異。為防止變異，必須將 標準株凍干保存。每月從凍干株中復蘇 1次，種入大豆酪蛋白消化肉湯中（厭 氧菌可用GAM肉湯等）作為工作株。工作株可存于 48C，并于每周轉種1 次。通常工作株轉種45次后即須棄去。在質控中，如發現工作株結果有疑問， 應予以更換。反復傳代亦易使其敏感性變異，特別是銅綠假單胞菌（ATCC2

9、7853），將會丟失對脲基青霉素的敏感性。如無凍干條件時，可于肉湯中加入 15%的甘油和脫纖維羊（或兔）血，或使用含 50%小牛血清的肉湯，然后接種 標準株，存于-20C以下環境中，亦可防止變異。3藥敏質控方法質控株應每天隨臨床分離株一道進行藥敏試驗質控株的藥敏結果如果在質控允許范圍內（參見最新NCCLS文件），說明實驗條件 符合要求，結果可信；若藥敏結果在質控允許范圍外，則實驗中可能存在差錯。 由于質控允許范圍的最大值與最小值是質控株在標準條件下多次重復實驗的 95%可信限，故20次連續質控結果中僅允許1次落在范圍外，但不能偏離質 控允許范圍中間值（最大值+最小值）/24個標準差。由于允許范

10、圍恰好包括 4個標準差，故落在允許范圍外的抑菌圈直徑一定要在離中間值一個允許范圍 （中間值土 1個允許范圍）之內。此外，20次或更多次藥敏結果的平均值應接 近中間值。如果20次連續質控結果中連續2次或不連續3次以上的結果超出 了允許范圍，則提示實驗過程中存在問題，必須查找原因加以解決。常規的藥敏質控可按下法進行：連續測定某藥對質控株的藥敏結果，每天 一次，共測30天，取得30個值。如果僅有三個以下的值超出允許范圍，則結果基本可信，可改每天質控 一次為每周一次。此后，若某周出現一次質控值超出允許范圍，則須連續質控 五天，每天一次：若五次結果皆在允許范圍以內，則繼續每周一次的質控； 五次結果只要有

11、一次失控，則改每周一次質控為每天一次，直至完成30天, 其間失控次數若在三次以內，則再改為每周一次。如果有四個以上的值超過允許范圍，則繼續做每天一次的質控。每當改變試劑、藥敏紙片和培養基等時，均要重新進行連續30天的質控。每次失控均要查找原因，糾正后才能發出報告。（三）培養基、試劑和染色的質控1培養基的質控 培養基無論是自制的還是商業購買的，都應注明生產日 期和效期。培養基的質控主要包括以下四個方面：無菌試驗，每批培養基在高壓或過濾除菌后均要抽取樣本進行培養，以證實無菌生長。支持生長試驗 以適宜的菌株接種，經培養應生長良好。選擇和抑制生長試驗，對選 擇性培養基應至少分別選1株可生長、1株被抑制

12、菌進行接種培養，可生長菌 應生長良好，被抑制菌應不能生長。 生化反應培養基至少應分別選陽性和 陰性反應菌株各1株，以證實應有的生化反應。常用的質控菌見表 2,請正確 選用。2生化反應試紙和試劑的質控試紙和試劑無論是外購的還是自制的，在使用時一定要注明開啟時間和失效期。測定代謝產物的試紙或試劑，要用已知 陽性和陰性的菌株進行測試，并作好測試記錄。測定代謝產物的試劑，要防止 細菌的污染。觸酶、氧化酶、凝固酶試劑在開瓶時以及使用中，每天至少要分 別用一陽性和陰性菌測試1次。桿菌肽、Optochin、ONPG、XV紙片（條）在開瓶時以及使用中，每周至 少要分別用一陽性和陰性菌測試1次（XV紙片僅做陽性

13、菌）。用于分枝桿菌鑒 定的試劑在開瓶或配制時，以及每次使用時，均要做陽性菌對照（鐵的攝取試 驗還要做陰性對照）。抗血清在開瓶時和使用中每月需分別用陽性反應和陰性反應菌做1次測試。抗原檢測試劑和DNA探針在每次操作時，均要設陰、陽性對照。其他試劑和紙片僅在開瓶或配制時， 做1次陰、陽性反應測試即可。各種 常用試紙和試劑的質控菌和預期結果見表 3。表2 常用的質控菌菌株名NCTC編號ATCC編號醋酸鈣不動桿菌784415308嗜水氣單胞菌78109071產氣腸桿菌1000613048陰溝腸桿菌1000513047糞腸球菌8213大腸埃布困900111775流感嗜血桿菌10211幽門螺桿菌33290

14、肺炎克雷伯困41815380普通變形桿菌417513315雷極普羅威登斯菌7475粘質沙雷菌11935遲緩愛德華菌11934鼠傷寒沙門菌7413311宋內志賀困9290金黃色葡萄球菌853212600表皮葡萄球困12228銅綠假單胞菌72447700無乳鏈球菌818113813肺炎鏈球菌746510015副溶血弧菌1090317802表3 試紙片（條）和試劑的質控試紙片、紙條或 試劑質控菌預期反應結果說明桿菌肽化膿鏈球菌敏感：24h內紙片任何抑菌區都認為是（A群）周圍有生長抑制區有效的，僅作為A鏈域的一個推定試驗糞腸球菌耐藥：24 h內周圍 無生長抑制區域觸酶金黃色葡萄球陽性：立即產生氣使用3

15、%出02，其活性菌、鏈球菌屬泡通過加幾滴H2O2到有陰性：無氣泡血的試管中來檢測凝集試驗含抗原的陽性質控菌陽性（膠乳）不含抗原的陰性質控菌陰性細菌抗原檢測抗原提取液陽性血漿凝固酶金黃色葡萄球菌陽性：在4 h內有 任何程度凝集表皮葡萄球菌陰性：無凝集或絲狀物生長因子流感嗜血桿菌24 h內在XV因子接種到浸液或M-H平X、V 和 XV周圍生長；24 h內皿，置X與V因子紙在X和V之間生長片相隔1cm,離XV因 子紙片至少6cm遠處， 空氣或CO2中孵育吲哚大腸埃布困、產培養24 h后，陽性：Kovacs 試劑和 Ehrlich氣腸桿菌界面為紅環；陰性：試劑產生同樣顏色，取界面為黃環其中一種即可甲基

16、紅大腸埃布困培養48h后，加甲 基紅立即紅色為陽常與V-P結果相反產氣桿菌性陰性：無顏色改變B -半乳糖甘酶大腸埃布困陽性：24 h內黃色(ONPG)普通變形桿菌陰性：無顏色改變奧普托辛肺炎鏈球菌24 h內敏感，有生敏感：6mm紙片，14(Optochin )長抑制區域mm區帶；10 mm紙 片，16 mm區帶草綠色鏈球菌耐藥：無生長抑制中敏：6mm紙片，7（a -溶血鏈球區10 mm區帶；10 mm紙菌）片，1115 mm區帶如果中敏，做膽汁溶菌試驗氧化酶銅綠假單胞菌1020 s內陽性：紫色到黑色大腸埃布困陰性: 不顯色1020 s內氧化酶紙片或紙銅綠假單胞菌陽性:30 s內紫色氧化酶試劑在

17、10 s內條大腸埃布困陰性:無顏色變化讀結果，或加到菌落上30 s內觀察結果吡嗪酰胺酶（耶小腸結腸炎耶爾陽性:15 min內紅于2530C下斜面培爾森菌屬瓊脂）森菌（非致病菌）棕色養48h，加新鮮的小腸結腸炎耶爾陰性:不出現紅棕10g/L硫酸亞鐵銨鹽于森菌（致病菌）色斜面上，非致病菌含有 吡嗪酰胺酶能轉化吡 嗪酰胺為吡嗪酸，在二 價鐵鹽存在的條件下， 后者呈棕色V-P試驗產氣腸桿菌培養48h后加試400 g/L KOH （水溶劑，若5 min內出液）;50 g/L a -萘酚（無現紅色為陽性（加水乙醇溶液）O-Meara試劑則于O-Meara為含 400 g/L大腸埃布困4 h后觀察結果 陰性

18、：無顏色變化 或僅為銅色KOH的肌酸溶液3 染色的質控 常用染色的質控要求見表4,質控結果應作好記錄。（四）儀器設備質量監測實驗室內的各種儀器設備的運行情況， 應每天進行監測，每一儀器均要有 專人維護保養，儀器上要貼有運行記錄卡，每天由維護保養人記錄溫度等指標 的變化情況。一旦發現問題，立即進行維修。（五）積極參加室間質評要按規定參加細菌學的室間質評， 對實驗室質控水平進行全面評估，不斷 提高檢測水平。表4染色液的質控染色質控頻率生物或其他物 質預期結果陽性 陰性鞭毛染色X開啟新瓶時和銅綠假單胞單或兩極鞭毛使用中每天一困、糞產堿桿周毛次菌革蘭染色XX開啟新瓶時和金黃色葡萄球陽性：紫紅到使用中每周一困、大腸埃布藍色的球菌次菌陰性：粉紅色到紅色桿菌Kinyoun 抗酸染色X開啟新瓶時和 使用中每周一戈登分枝桿菌以藍色為本底 的短、長和成次團的粉紅色桿菌芽胞染色X開啟新瓶時和芽胞桿菌屬任菌體中含有不使用中每天一一種腫脹的卵圓形次芽胞，芽胞可 被單染（顏色 依所用染料而 定），而桿菌可染成對比色Ziehl-Ne