1、研究背景：有報道顯示我國兒童與青少年的錯牙合畸形患病率為67.82 1。頜面部畸形直接影響到兒童頜面部生長發育、口腔健康、功能和容貌外觀以及心理健康。正畸矯治的病患隨著生活水平的增加也逐年增多。正畸固定矯治中，很多患者在矯治過程中會出現牙齒表面釉質脫礦的現象。有研究顯示，牙齒表面釉質在固定正畸矯治過程的脫礦率大約為 2-97%2, 3 。這些現象可能與正畸矯治器的粘接有關，因為在固定矯治過程中牙齒上需要粘接托槽、帶環等矯治附件，這些附件可能會使牙齒表面清潔受限、軟垢滯留，從而影響口腔健康。但是在臨床治療過程中我們也經常發現，有些正畸固定矯治的患者雖然在矯治過程中軟垢很多、口腔衛生很差，而且矯治

2、時間較長，牙面也未出現明顯的脫礦現象 11 。那么在固定正畸矯治過程中的釉質脫礦的原因是什么呢？本研究從微生物學方面對正畸患者佩戴矯治器前后進行菌群測定，分析正畸患者在固定正畸矯治前后口腔菌群的變化及其與口腔健康的關系。研究目的：探討正畸固定矯治前后患者口內菌群的變化；將患者口腔菌群的變化與患者口腔健康相聯系研究兩者之間的相關性。研究方法：從 2013 年 8 月-2014 患者中隨機選取口內牙齒沒有明顯脫礦患者20 名，于正畸矯治前刮取其上頜前牙牙區菌斑，分為未治療組組；選取正畸治療超過六個月并且前牙未出現明顯脫礦且口腔健康狀況良好患者20 名，取同樣區域菌斑為正畸治療組。年8 月間在山東大

3、學口腔醫院正畸科正在進行固定正畸矯治。取牙面菌斑樣本，菌斑基因組 DNA 提取后 PCR擴增，最后對擴增子進行測序和分析，檢測正畸前后口內菌群的變化情況。結果：研究結果顯示來自正畸治療組的菌斑多樣性與未治療組沒有明顯差異（P 0.05）。實驗測得口腔內約有 238 個不同的細菌菌屬與維持口腔微生態平衡有關。其中10個屬的細菌含量較高，占整個口腔的 70 ，分別是 Parascardovia ， Rothia, Corynebacterium, Leptotrichia, Streptococcus, Selenomonas, Prevotella, Capnocytophaga,Hylemon

4、ella 。通過將正畸前后牙面菌斑比較，我們發現有6 個屬的細菌存在差異。6個屬的細菌包括在 Parascardovia, Leptotrichia, Corynebacterium ，Streptococcus ， Selenomonas, 以及 Prevotella 。我們的實驗結果表明，正畸治療前后菌群結構存在一定的差異性，多種菌屬與齲病的發生可能存在正相關或負相關關系，而這種菌屬的改變在臨床并未引起相應口腔健康的改變，我們可以認為在正畸治療以后口腔內微生物菌群建立了一個新的穩定生物體系。結論：患者戴用固定矯治器后，出現了局部牙面菌斑中 Streptococcus, Corynebact

5、erium, Leptotrichia, Antinomycetes, 以及 Lactobacillus 總菌群中含量明顯增高的情況。本研究結果提示，患者戴用正畸固定矯治器后，局部牙面菌斑中的菌群構成發生改變，并且進入一種新的穩定平衡狀態。關鍵詞： 固定正畸治療16S rDNA 菌屬含量前言臨床上正畸患者的口腔衛生的保持一直是比較難以維持的。在臨床上我們就經常發現許多固定正畸矯治的患者在矯治過程就發生了牙面脫礦的現象。顯然這與牙面菌斑在固定正畸矯治的附件周圍聚集有一定的關系4, 5 ?？赡苁且驗樵谡委熯^程中會出現口內菌群的紊亂，牙周治病菌以及致齲菌比例增多的現象，從而導致牙周炎以及釉質脫礦

6、的發生。有研究顯示，固定矯治過程中發生釉質脫礦的概率大約為2-97% 2,3 ，其主要表現為脫礦牙釉質表面光澤度下降呈白堊色，影響美觀，嚴重者可導致齲的發生 4 。也有調查顯示固定矯治器粘接6 個月內脫礦的發生率明顯增加，6-12 個月間脫礦發生率也會有所上升1 。另一方面在臨床治療過程中也經常發現，有些接受正畸固定矯治的患者即使在矯治過程中軟垢很多、口腔衛生很差，同時矯治時間較長，牙面也未出現明顯的脫礦現象以及牙周疾病，在這種情況下口腔內菌群又發生了什么樣的變化？本實驗使用16S rDNA 測序的方法，分析口腔菌群在正畸前后發生的變化。16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括10 個

7、保守區域和9 個高變區域，保守區在細菌種屬之間沒有很大的差距，而高變區域在細菌種屬之間有明顯的差異。因此，16S rDNA可以做作為分別生物物種的特征核酸序列，已經被廣發認為是可以較快且準確分析細菌系統和分類鑒定的指標。以往454 測序平臺以讀長優勢廣泛應用于16S rDNA 測序領域，但是隨著MiSeq 平臺雙端 PE250 和 PE300 測序策略的發展，讀長不斷增長，使得基于 MiSeq 測序研究物種多樣性的準確性大幅度提高7 ，所以已經成為研究微生物群落多樣性的首選之策8,9 。根據所擴增的16S 區域特點，基于Illumina MiSeq測序平臺，利用雙末端測序（ Paired-En

8、d ）的方法， 構建小片段文庫進行雙末端測序。通過對 Reads 拼接過濾， OTUs(Operational Taxonomic Units) 聚類，并進行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品物種構成；進一步的多樣性分析 (Alpha Diversity)， 多樣性分析 (Beta Diversity) 可以分析樣品之間的差異。本研究從微生物學方面應用 16S rDNA 測序的方法對正畸患者佩戴矯治器前后進行菌群測定，分析在正畸固定矯治前后患者口內菌群的差異及其影響。材料與方法1. 實驗材料1.1 實驗試劑（1） PBS 緩沖液（上海研域試劑有限公司）（2） Phusion? High-Fide

9、lity PCR Master Mix（New England Biolabs公司）（3） GC 緩沖液（ New England Biolabs公司）（4） DNA 純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）（ 5）藍白斑篩選試劑（上海生工生物工程有限公司）（ 6）胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（上海生工生物工程有限公司）（ 7） Eppendorf 管（海門市盛邦實驗器材有限公司）1.2 主要儀器設備（ 1） DL CJ IN 型高性能超凈工作臺 （哈爾濱市東聯電子技術公司）（ 2） MLS 3750 型高壓滅菌器 （日本 SANYO 公司）（3） MDF 一 382E 型超低溫冰箱（日本

10、SANYO 公司）（4） TGL_16G 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）（5） ND 一 2000C 型微量紫外分光光度計（美國NanoDrop 公司）（6） PowerPac 3000 型 Bio rad 電泳儀（美國BIO RAD 公司）（7） 1 70 4406 型小型水平電泳槽（美國BIO RAD 公司 ）（8） GelDoc 2000 型凝膠成像系統（美國BIO RAD 公司）（9） LightCycler 480 Real Time PCR 儀（瑞士 Roche 公司）（ 10 ）微量移液器（德國 Eppendoff 公司）（ 11 ）生物安全柜（哈爾濱市東聯電子技術開發有

11、限公司）（ 12 ）梯度 PCR儀（德國 Biometra 公司）2. 實驗方法2.1 研究對象2.1.1 研究對象的選擇從 2013 年 8 月-2014 患者中隨機選取口內牙齒沒有明顯脫礦患者20 名，于正畸矯治前刮取其上頜前牙牙區菌斑，分為未治療組組；選取正畸治療超過六個月并且前牙未出現明顯脫礦且口腔健康狀況良好患者20 名，取同樣區域菌斑為正畸治療組。每位受試者的共同納入標準：（ 1）近期居住在山東地區的漢族人群，有相似的飲食習慣；（ 2）口腔衛生可，沒有明顯牙周炎，齲病以及釉質脫礦等口腔疾??；（ 3）近 1 個月內未使用抗生素、益生菌或益生元等微生態制劑；（ 4）無其他嚴重全身疾病及

12、并發癥，女性非妊娠期或哺乳期；（5）近 1 年內未接受過牙周治療；（ 6）無吸煙史；（ 7）年齡在 14 至 28 歲。2.1.2 對研究對象的年齡分布均衡性檢驗對患者年齡分布均衡性檢驗經 2 檢驗結果顯示，實驗組以及對照組年齡分布具有均衡性（見表 1 ）表 1 患者年齡均衡性檢驗（ X+SD, 單位：歲）指標分組 P 值未治療組正畸組年齡（歲）19.6+3.31 21+3.28 0.321說明： p 值0.05 ，組間數據結構無顯著差異2.2 臨床參數和標本收集2.2.1 問卷調查問卷主要包括(姓名、性別、年齡、民族、聯系電話、家庭住址、身高、體重、生活等) 、全身系統性疾病史、口腔相關信息

13、 ( 是否有刷牙或咬硬物出血、是否有牙齒松動或咀嚼無力、牙周治療史、牙周炎家族史 )。2.2.2 臨床檢查檢查患者口內有無齲壞，有無缺失牙齒。使用Williams 牙周探針，檢查并記錄每位受試者現存牙 ( 第三磨牙除外 ) 的牙周臨床指標，包括探診深度(PD) 、附著喪失 (AL) 、探診出血 (BOP)。所有檢查均由同一名醫師完成。2.2.3 實驗樣本收集選取口腔衛生較好的患者作為實驗群體，樣本采集時間在飯后2-4 h ，采樣前先用清水鼓漱約 1min ，以除去食物殘渣，隔濕、干燥后用無菌探針于患者下頜前磨牙唇頰側托槽齦方牙面刮取適量菌斑。置于 2ml 無菌 eppendorf 管（取樣前稱

14、重并記錄其重量，盛有 PBS轉運液），半小時內送至實驗室，再次稱重取差值得樣本質量。2.2.4 菌斑 DNA 的分離將存儲菌斑標本的緩沖液解凍后，抽提菌斑細菌基因組DNA，具體操作過程如下：（ 1）解凍后的存有樣本菌斑的緩沖液離心，15,000rmp 離心十分鐘，去除上層清液。（ 2）在沉淀中加入裂解液 ATL，上下顛倒使之混勻。（ 3）在每管中加入 20L 蛋白酶 K 溶液以及鋯珠，顛倒使之混勻，在振蕩器上振蕩 3 次，每次 1min 。（4）振蕩完成后，在56的水浴箱中靜置45min 。（5）于每管中加入200 L 裂解液 AL,混合均勻后置于70的水浴箱中40min 。（6）加入 200

15、 L 無水乙醇，混合均勻后加入分離柱中，簡短離心。（7）丟棄過濾液，把分離柱放入新的收集管中，用AW1，AW2 清洗兩次。（8）最后用 10 L 洗脫液洗脫 DNA 兩次，提取后的DNA-20 保存。2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度1. 制備 1% 的瓊脂糖凝膠，稱取0.4g 的瓊脂糖加入40mlTBE 緩沖液中，微波爐中加熱至瓊脂糖完全融化，在室溫條件下冷卻到65 左右。2. 在瓊脂糖中加入 3.0 L 銹乙錠貯存液，將其緩慢倒入事先準備好的制膠器中，防止出現氣泡，凝膠的厚度控制在 0.3-0.5mm ，室溫下放置至凝膠完全凝固，小心取出梳子，將制備好的凝膠放入電泳槽內。3

16、. 在電泳槽內加入 TBE 緩沖液至液面剛剛淹沒凝膠表面。4. 將制備好的產物與 10 上樣緩沖液混勻，將其加入到上樣孔中，同時在一邊加入5.0L 的 DNA 分子 maker 。5. 通電進行電泳，電壓 100V 開始電泳，根據指示劑遷移的位置決定是否停止電泳，觀察電泳結果（如圖 1）。2.2.6 PCR 擴增取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1ng/ l。稀釋后的基因組DNA 為模板；根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物；使用 New England Biolabs 公司的 Phusion? High-FidelityPCR Master Mix 。引物對應區域：

17、 16S V4 區引物為 515F-806R ； 18SV4 區引物為 528F-706R ；18S V9 區引物為 1380F-1510R ； ITS1 區引物為 ITS1F-ITS2 ； ITS2 區引物為： ITS2-3F-ITS2-4R 。50 LPCR 擴增體系為 : DNA 模板量 : 1.5 L， dNTP( 200 mol/L):4 L，10Buffer:5 L, Taq 酶 ( 5 U/ L) :0.25 L， Primer(10 mol/L):2 L，補足 ddH2O 至 50 L。PCR 反應程序為 :94 3min 變性（ DNA 雙鏈解離）94 1min 變性65 5

18、6 1 min 退火 30 個循環72 1min 延伸72 7min4 10min2.1.3 PCR 產物的混樣和純化根據 PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物 ,結果如（圖 2），因濃度較低進行第二次PCR，以及 PCR產物檢測（圖3， 4）.使用 Thermo Scientific公司的 Gene JET 膠回收試劑盒回收產物。2.1.4 文庫構建和上機測序使用 New England Biolabs公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經

19、過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用 MiSeq 進行上機測序。2.2 信息分析將測得的原始數據進行過濾分析，去除干擾數據（包括接頭信息，低質量堿基，未檢測出的堿基等），得到有效數據。然后基于有效數據進行OTUs 聚類和物種分類分析，并將 OTU 和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs 和分類譜系的基本分析結果。再對 OTUs 進行豐度、多樣性指數等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。最后在以上分析的基礎上，可以進行一系列的基OTUs、物種組成的聚類分析，PCoA 和 PCA、CCA 和 RAD 等統計比較分析，挖掘樣品之間的物種組成差異，并結合環境因素進行關

20、聯分析。結果1.16SrDNA 測序后所得結果經過 16SrDNA 測序后，一共得到751,858 條基因序列，經過對原始數據的拼接，過濾，得到約 710 ， 825 條高質量的有效數據，測量結果如表（ 2）。其中正畸前有效數據為 360 ，632 條，正畸后的有效數據為 350,193 條。平均序列長度為 253bp 。表（ 2）數據產生的統計信息表2. 正畸矯治前后口內牙面菌群的豐度和分類2.1 物種信息的讀取數據以及初步分析為了研究樣品的物種的組成多樣性信息，對所有樣品的全部EffectiveTags序列聚類，以97% 和95% 的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs (Op

21、erationalTaxonomic Units)結果。在 OTUs 構建過程中，對不同樣品的Effective Tags數據，低頻數的 Tags 數據和 Tags 注釋數據等信息進行初步統計，統計結果的展示（見圖5）。將兩組以 97% 的一致性聚類成為的 OTUs 數目進行方差分析，發現非矯治組與正畸矯治組的 OTUs 數目沒有明顯差異（ P 0.05 ）。選取最大相對豐度排名前10 個屬所對應的OTUs 的系統發生關系數據，并結合每個OTUs 的相對豐度及其代表序列的物種注釋置信度信息，整合結果展示（如圖6）所示，可以直觀的展示研究環境中的物種組成的多樣性。2.2 正畸前后患者口內菌群的豐

22、度和分類2.2.1 樣品復雜度分析(Alpha Diversity)Rarefaction Curve ，即稀釋曲線（見圖7) ，是從樣品中隨機抽取一定測序量的數據，并且統計這些數據所代表物種數目 ( 也即是 OTUs 數目 ) ，以抽取的數據量和所測得的相應物種數來構建的曲線。所以稀釋曲線可以直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的OTUs。同時從Rarefaction curve也可以看出每組樣品中在在3非相似度 (cutoff) 上各個組可以得到約200 種左右的種系。2.2.2 多樣品比較分析(B

23、eta Diversity)Beta多樣性研究中，選用Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac兩個指標來衡量兩個樣品間的相異系數，其值越小，表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離繪制的Heatmap展示結果（見圖 8）。我們從圖中可以看出 EX1.4，EX1.5， EX1.7， EX1.8，EX2.2,NC1.1 ， NC1.2 ，NC1.3， NC1.6 ，NC1.7 ， NC1.8 與另一組在物種多樣性上差別較大。2.2.3PCA 分析主成分分析(PCA， Principa

24、l Component Analysis)，是一種應用方差分解，對多維數據進行降維，從而提取出數據中最主要的元素和結構的方法26 。PCA 能夠提取出最大程度反映樣品間差異的兩個坐標軸，從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上，進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。如果樣品的群落組成越相似，則它們在PCA 圖中的距離越接近。展示結果見圖92.3 在門水平上進行分類將測序樣品的序列進行比對，在生物分類學門的水平進行分析，主要有10 個門的細菌發現。它們分別是： Tenericutes ， Synergistetes ， Spirochaetes ，Proteobacteria ， Firmicutes

25、 ，Cyanobacteria, ， Bacteroidetes ， Actinobacteria,TM7,Fusobacteria 。其中有五個門的細菌在其中占主要地位。它們分別是：Actinobacteria ， Firmicutes ，Proteobacteria ，Bacteroidetes和 Fusobacteria ，并且其中有四個門的細菌在正畸組中較非正畸組中有明顯升高，它們分別是Firmicutes ， Bacteroidetes ， Actinobacteria,Fusobacteria 。2.4 在屬水平上進行分類在屬水平進行分類，可以得到 145 個不同的屬。其中 10

26、個屬的細菌含量較高，占整個口腔的 70，分別是 Parascardovia ，Antinomycetes, Corynebacterium, Leptotrichia,Streptococcus, Lactobacillus, Prevotella, Capnocytophaga, Hylemonella。通過將正畸前后牙面菌斑比較，我們發現有5 個屬的細菌存在差異。5 個屬的細菌包括在Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes,以及 Lactobacillus 在正畸組中有明顯升高。2.5 在種水平進行分類兩組之間存

27、在著大量相同種的細菌將其中齲病主要致病菌Streptococcus,Antinomycetes, 以及 Lactobacillus 前后數據提取出來統計分析，分析結果（如圖10，表 3）表（ 3）非治療組與正畸組比較變形鏈球菌放線菌乳桿菌分組 P值 P值 P值非治療組 P0.05P0.05P0.05正畸組 P0.05P0.05P0.05說明：未治療組與正畸治療組各組相比P 值均小于 0.05討論1. 關于實驗選擇牙面的討論我們在臨床可經常發現在固定正畸治療過程中上前牙區以及上頜磨牙區是最常會出現釉質脫礦現象。并且有學者統計發現上前牙是在正畸固定矯治過程中最好發生牙釉質脫礦的牙位 10 ，一般主

28、要發生在牙面的唇頰面牙釉質，主要以托槽邊緣處最為明顯12 。同時也有國內外很多學者發現上頜牙齒的脫礦率高于下頜牙齒13 ，并且上頜側切牙的脫礦率最高。因此，由于上頜側切牙的脫礦率最高，可能也相對說明上頜側切牙區牙面菌斑的成分改變較明顯，故本實驗選擇上頜側切牙作為實驗的取樣牙位。由于本部分研究的目的是分析固定矯治器戴用后牙面的菌群變化情況，而我們在臨床上觀察發現，戴用固定矯治器后雖然有比較高的釉質脫礦發生率，但大部分的患者還是沒有出現釉質脫礦的現象。故我們在研究中選用了在固定矯治過程中沒有出現脫礦的患者做為研究對象，這樣可以比較好地反映固定矯治器戴用后牙面菌群變化的一般趨勢。同時本研究的樣本量不

29、是很大，如果將發生釉質脫礦的患者也包含在戴用固定矯治器的患者中，與未行正畸治療的個體進行比較，可能會因為發生脫礦的患者牙面菌群變化比較大，而對研究結果造成一些偏差。2. 正畸固定矯治與口腔健康的相關性在臨床中經常可見在固定正畸治療過程中引起許多口腔健康問題，比如釉質脫礦，牙齦炎，牙槽骨吸收等等。造成這些口腔疾病的因素很多，但大部分研究認為口腔內菌群的變化往往是直接作用因素。在正畸固定矯治過程中最常見的口腔疾病之一就是牙面釉質脫礦。目前很多研究顯示，多種致病菌與釉質脫礦相關，其中最主要包括變形鏈球菌、乳桿菌、放線菌等 7 。本實驗中對正畸矯治前后牙面菌斑的測定，來分析口腔內菌群的變化，從而得出正

30、畸固定矯治對口內菌群的影響。在一定程度上，固定矯治過程中釉質脫礦問題的發生，可能與局部牙面菌斑中變形鏈球菌，放線菌以及乳桿菌數量的增多有一定相關性。已經有學者的研究14 中發現固定矯治器戴用三周后，牙面菌斑中總菌數并沒有顯著增加，但是變形鏈球菌比例卻有顯著性的增高。在正畸固定矯治中發生的牙面釉質脫礦，與齲病早期的釉質脫礦是相似的，如果這種脫礦問題得不到控制，進一步發展都可能形成牙面齲損。很多研究也都已經顯示出變形鏈球菌是齲病發生的主要致病菌。雖然目前研究顯示乳桿菌和放線菌不是齲病發生的主要致病菌，但是這種細菌的增多會使菌部牙面的酸性環境增強，易于釉質脫礦情況發生。由此可見，本研究顯示的固定矯治

31、器戴用后出現的牙面局部菌斑中變形鏈球菌，放線菌及乳桿菌，與固定矯治器戴用后易出現釉質脫礦問題是有一定的機制相關性。這種情況的產生可能與固定正畸矯治器附件粘結后，患者未能充分做好口腔的清潔，使得牙面軟垢附著增多 14 ，繼而使致齲菌易于大量聚集有關。有研究顯示有釉質脫礦的牙面其表面變形鏈球菌的數量多于鄰近沒有脫礦的牙面 32 。本研究雖然結果顯示固定矯治器戴用后牙面局部菌斑中放線菌及乳桿菌的數目及其在總菌群中所占比例明顯增高，但是牙面并沒有出現脫礦的現象。也就是可能在固定矯治過程中，牙面局部菌斑中菌群的改變能夠進入一種矯治過程中的平衡狀態。首先我們可以看到，固定矯治過程中雖然比較容易出現釉質脫礦的現象，但不是每個患者都出現釉質脫礦的問題。而且我們實驗中所選的固定矯治患者就是在矯治過程中沒有出現明顯釉質脫礦的患者，而我們的研究結果顯示這些患者牙面菌斑中有變形鏈球菌，放線菌和乳桿菌增多的情況，說明戴用固定矯治器后，雖然局部牙面菌斑中出現了致病菌增多的情況，但這并不意味著患者就