1、第四章 染色與染色劑 未加染色的切片在顯微鏡下除了能夠辨認細胞和包核的輪廓以外，看不清楚其他任何結構。即使由于組織內部各種物質的折射指數不同，從光線的明暗上能使我們看到一些組織結構，但也是極其簡單而有限的。遠遠不能滿足觀察和診斷的要求。我們不僅要通過顯微鏡視野來看到組織和細胞的形態結構，而且還要通過組織和細胞的形態變化來研究它的發生和發展。因此染色的技術才逐漸發展成為制片過程中的一個重要環節。它較固定、脫水、包埋、切片等步驟遠為復雜，理論性強，技術要求嚴格，已經成為一門獨立的科學，它在組織學，病理學等學科中已占有相當的地位。第一節 染色的基本原理染色就是利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織

2、或細胞內的某種成分發生作用，經過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細結構能顯現不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細胞的各種成分。染色劑與組織細胞相結合而使組織細胞著色的過程與物理和化學作用兩者都有關系。一.染色的物理現象1.溶解性：這種染色最典型的例子就是脂肪染色，蘇丹類染色劑為脂溶性染料，它可以被脂質溶解，使脂質著色，就是利用染色劑在脂質中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度這一特性。因此，當蘇丹類的酒精溶液與組織細胞中的脂質接觸時，染色劑就從溶液中“轉移”到脂質中去，而使脂質著色。2.吸附作用：較大物體有從周圍介質吸附小顆粒到自身的特性。有些染色則是染色劑分子通過滲透和毛細管作用而被吸

3、收或沉淀到組織，細胞的小孔中去而著色的。例如活性炭吸附各種分子，甚至膠質和微生物等較大的顆粒一樣。二.染色的化學反應酸性染料和堿性染料的染色作用常是對立的，而不是一致的。任何染料均可電離，離解出陽離子或陰離子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是陰離子；堿性染料中的堿性部分有染色作用的是陽離子，細胞內同時含有酸性和堿性物質，酸性物質與堿性染料中的陽離子相結合，如細胞核（含有核酸）黏液和軟骨基質呈酸性部分被鹽基性染料蘇木素所染、反之堿性物質與酸性染料的陰離子相結合，如細胞漿及其內部的某些顆粒物質被酸性染料伊紅所染。染料的顏色基不是在陽離子，就是在陰離子上，這些離子將因組織反應不同而發生化學結合，如

4、顯示含鐵血黃素的普魯士蘭反應是最典型的例子。但是，大量染色的化學反應并不象鐵反應那樣明確，實際情況遠為復雜。這是因為蛋白質分子是個分子量自幾萬至幾百萬的大分子，每個分子中含有很多陽離子和陰離子基因，在等電點時能形成游離的兩性離子，如：COOH COO-PP NH2 NH3+ P為蛋白質，是具有兩性的膠體物質。它呈酸性或堿性與環境的PH值有關，如溶液的PH值小于該蛋白質的等電點則此溶液對該種蛋白質即為酸性，蛋白質就帶正電，將被酸性染色劑所著色。反之，溶液的PH值大于蛋白質的等電點，則此溶液對該蛋白質來說即為堿性,蛋白質帶負電，將被帶有陽離子的染色劑所浸染。 在日常工作中，長久固定于甲醛的組織切片

5、，往往染色不良，尤其是核的著色欠佳。這是因為固定液甲醛氧化生成甲酸，組織亦隨之變為酸性，所以不易被蘇木素所著色，補救的辦法是，先用流水沖洗組織塊，然后用堿性溶液如稀氨酒精等處理使之中和，恢復正常PH值后再進行染色。大多數染色的原理至今仍未搞清楚。有些可能是物理的，有些可能是化學的，有些則可能兩種機制都起作用，正因為人們對染色的原理還沒有完全掌握，所以目前還不能很好地運用原理來控制它。在相當程度上要憑借工作經驗。因此“染色”成為技術性很強的一項工作。在進行每一種染色方法時，必須注意不斷地有意識地去積累經驗，從成功與失敗中去真正掌握該染色技術。三進行性染色和退行性染色組織成分著色由淺至深，當達到所

6、需要的強度時，終止染色。這種方法稱為進行性染色。一般所采用的染液濃度較低，染色過程中應該不時在鏡下觀察以進行控制，這樣才能得到染色強度適中的效果。此種方法無需“分化”，例如，卡紅染色。退行性染色，則是先把組織濃度過度，超過所需的程度，然后再用某些溶液脫去多余的染色劑，以達到適當的深度，并使不應著色的組織細胞脫色，這個步驟稱為“分化”。在分化中進行鏡下觀察，當然也是必不可少的。H.E染色中用蘇木素染核就是退行性染色。四直接染色，間接染色和媒染劑有些染色無需第三種物質參加，染色劑和組織即可直接結合著色，是為直接染色。直接染色最后達到的深度與染液的濃度和組織細胞對染色劑的親和力相關。還有一些染色，單

7、獨燃料本身的水溶液或酒精溶液，幾乎不能與組織細胞結合或結合的能力很弱，必須有第三種成分媒染劑參與，才能使染色劑與組織細胞有效地結合起來，這種染色方法稱為間接染色。媒染劑通常是雙價或三價金屬如鋁，鐵的硫酸鹽或氧化物。媒染劑有的加在染液中，媒染作用在染色的同時進行（如Ehrlich氏蘇木素染色）；有的則用于染色前，媒染劑單獨配成溶液，固定液本身就起著媒染的作用（如Wallory氏磷鎢酸蘇木素染色用Zenker或 Helly氏固定）；有時則用于染色后。媒染劑在染色中起著架橋作用，既能與染料結合又能與組織相結合，達到了促進染色的效果。例如蘇木素就需要明礬作媒染劑，才能使組織著色。媒染劑往往在一些間接染

8、色反應中幾乎是必不可少的。五促染劑用以加強染料和組織細胞結合能力的物質稱為促染劑。如染胞漿時伊紅液中滴加的冰醋酸，有加強其染色作用，增加了有色酸對蛋白質堿基的結合力。促染劑與媒染劑不同，有時為了加快染色過程，可在染液中加入接觸劑促進染料與組織細胞著色，但其本身并不參與染色反應。促染劑有如化學反應中的催化劑，少量存在就有明顯的促染作用。它們的作用機制也許是降低表面張力或是改變了染液的PH值.六分化劑在退行性染色中，附在組織細胞上多余的染色劑需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脫去，從而使目的物與周圍組織形成鮮明的對比，同時使目的物本身的色澤也深淺適當。這種選擇性地除去多余染色劑的過程稱為“分化”

9、，所使用的溶液即是“分化劑”。分化劑大致可歸納為三大類：（一）酸性分化劑：如冰醋酸和鹽酸。它們能與媒染劑（金屬）相結合形成可溶性鹽類，從而打開了媒染劑和組織細胞的結合，使組織細胞脫色，另外，它能分解和防止形成染料的沉淀色素。如Ehrlich氏蘇木素液當酸性時，溶液為褐紅色，正是由于色素根來與鋁化合成蘭色的“沉淀色素”，之故，一旦將切片投入堿性溶液，則組織立刻呈現藍色，說明沉淀色素已經形成，但若以1%鹽酸酒精分化，則又恢復了紅色，此即表示沉淀色素又被溶解。（二）氧化分化劑：其作用實際上是種簡單的漂白，如苦味酸，鉻酸，重鉻酸鉀，高鐵氰化鉀和過錳酸鉀等，這些都是一些氧化劑，可將組織上所有的染色劑無選

10、擇地氧化而呈無色，猶如漂白作用。但由于這種氧化作用的速度較慢，首先脫去的必是染色較淺的，染色較深的組織細胞還可保留部分染色劑，這樣就達到了分化的效果。（三）媒染分化劑：媒染劑能促使組織細胞和染色劑相結合。如果將已染色的切片再放到媒染劑的溶液中，則可使已經和組織相結合的染色劑脫去，這是媒染劑的另一種功能。從這個角度看，又可稱之為“媒染分化劑”。它對組織既能使染料附著，又能脫去染料，二者初看似乎矛盾，其實不然，這是因為染色劑和媒染劑的比例關系不同，當溶液中媒染劑的量超過了染色劑的量時，占有壓倒優勢的媒染劑就把已經和組織細胞相結合的染色劑奪取過來，使組織細胞脫色，即為分化現象。當然，含染料較少的組織

11、必然先被脫色，而著色較濃的組織隨著分化時間的控制，即可保留必要的顏色，從而達到分化的目的。既然分化劑有脫色的作用，因此分化劑本身也是脫色劑。一張褪色的切片，需要再染時，第一步就是用脫色劑加以處理。在常規染色中，分化劑必須嚴格掌握，再根據經驗進行鏡下觀察，控制染色效果。七.變色反應和正色反應大多數染料可將組織染成同一顏色的不同深度；例如：酸性品紅總是將組織染成不同色調的紅色。淡綠染成不同色調的綠色。這些染色反應最后目的所呈現的顏色和染色劑的顏色相同，稱為正色反應。然而有些組織成份可被煤焦類，某些堿性染料染成與染料不同的另一種顏色；如黏液用甲苯胺藍可染成紅色，而其余組織則染成不同色調的藍色。此種染

12、色反應最后目的物所呈現的顏色和染色劑當初的顏色不同，則稱為變色反應。也叫做異染現象。這種組織稱為顯示異染性，這種染料叫做異染染料。顯示異染現象的主要組織成分有黏液，軟骨和肥大細胞顆粒。第二節 染色劑染色的化學基礎 作為一種生物染色劑，必須同時滿足兩個要求：具有鮮艷透明的顏色，而且能與組織細胞相結合。染色劑分子能夠顯示顏色的基因，稱為發色團。主要的發色團有： N=N， N=O， C=O ， C=C 偶氮基 亞硝基 羰基 烯基 亞硝基和偶氮基顯示的顏色較強，在染色劑中有一個這樣的發色團，就可染出顏色。其他的發色團則不是這樣，必須有幾個發色團，有醌的分子中就有四個發色團，（2個羰基2個烯基）。大量的

13、合成染料都是由煤焦油蒸餾得到的，它們都是苯的衍生物，所以苯環是合成染料的基礎。苯本身是無色的，但其氫原子為某發色團取代后就帶有了顏色。含有發色團的苯環化合物，稱為色原。苯+發色團=色原色原還不能很好地與組織細胞相結合，即使著了色也很容易脫去。因此僅僅具有色原還不能成為染色劑，染色劑分子中還需具備促使染色劑與組織細胞相結合的基因，這樣基國在稱為助色團。如NH2 COOH OH SO3H 氨基 羧基 羥基 磺酸基氨基在溶液中形成陽離子（+），為堿性；其它羥基，羧基和磺酸基皆帶陰離子（-）故為酸性。如三硝基甲苯是個色原，它雖有發色團硝基，但因缺乏助色團，所以沒有染色作用，不能稱為染料。假如三硝基苯分

14、子中的一個氫原子被羥基置換，則所生成的化合物既具有發色團而又得到了助色團羥基，這就成了常用的酸性染料苦味酸。 這就可以看出，助色團的作用在于使色原形成鹽類，可以在溶液中電離成為帶電的離子，這樣才能與相應的組織細胞的成份相結合。第三節 染色劑的分類一、按來源可以分為1.天然染色劑：主要是蘇木素，胭脂紅，地衣紅，番紅花。2.合成染色劑：是從煤焦油中提取的苯衍生物。在生物染色中還使用一些無機化合物，如硝酸銀，氯化金，磺，鋨酸，高錳酸鉀等。二、按主要用途分為1.胞核染色劑：蘇木素，胭脂紅，甲苯胺藍，美藍，孔雀綠等。2.胞漿染色劑：伊紅，淡綠，橘黃G,酸性品紅,苦味酸等。3.脂質染色劑：蘇丹，蘇丹，蘇丹

15、黑，硫酸尼羅藍及油紅等。三、按染色劑分子中的發色團可分為九類1.亞硝基類：發色團為亞硝基（-NO)如萘酚緣-B。2.硝基染料：發色團是硝基（-NO2）如苦味酸。3.偶氮類：發色團為偶氮基（-N=N-）屬于這一類的染色劑的橘黃G,剛果紅,俾士麥棕和許多蘇丹類的脂質染色劑。4.醌亞胺類：這類染料含有兩個發色團，一個是印胺基（-N=），一個是醌型苯環，如硫堇，美藍，甲苯胺藍O,硫酸尼羅藍,中性紅,堿性藏紅花O，焦油紫等。5.苯甲烷染料：發色團是醌型苯環，如孔雀緣，淺綠，堿性品紅，酸性品紅，結晶紫，甲基緣等。6.山叮染料：發色團是醌型苯環，如派羅寧，伊紅Y等。7.蒽醌染料：此類染色劑含有色原蒽醌，如茜

16、素和胭脂蟲酸。8.噻唑類。9.喹啉類。8，9類染色劑使用極少。四、按染色劑的化學性質分類染色劑的干粉是穩定的鹽類，它們在溶液中則電離成酸性或堿性染色劑。如酸性染色劑，能夠產生氫離子（H+)或其它陽離子(Na+),而其本身成為帶負電荷的陰離子者。這類染色劑一般用于染細胞漿，如伊紅Y，苦味酸，橘黃G等。堿性染色劑，能產生氫氧根離子（OH -)或其它負離子(如Cl-),而本身成為帶正電荷的陽離子者。這類染色劑常用于染細胞核,如堿性品紅等。1.酸性染色劑：色原助色團Na色原-助色團+Na+。常用的如伊紅，酸性品紅，苦味酸，橘黃G，剛果紅，水溶性苯胺藍，淡綠等酸性染料常用以染細胞漿等堿性成份。2.堿性染

17、色劑：色原助色團Cl色原-助色團+Cl。常用的如蘇木素,卡紅,次甲基藍,甲苯胺藍,硫堇,美藍等堿性染料常用以染細胞核等酸性成份。嚴格地說，酸性染色劑的溶液并不一定呈酸性。同樣，堿性染色劑的溶液也未必呈堿性。所謂酸性和堿性染色劑僅指它們電離后其分子的主要染色部分是陽離子還是陰離子。因此稱為陽離子型染色劑或陰離子型染色劑更為適當。常規H.E染色中蘇木素染液的PH值約為7，此時胞核的化學成份電離產生H+，而其本身成為帶電荷的陰離子，所以被陽離子型的堿性染料劑所著色。伊紅染液為弱酸性。細胞的化學成份從溶液中獲取H+而成為帶正電荷的陽離子，因此與陰離子型的酸性染色劑（伊紅）相結合，染作紅色，這就是H.E

18、染色分別顯示核和胞漿的機制。3.中性染色劑：這是酸性染色劑和堿性染色劑的復合物，又可稱為復合染料。是由堿性染料（色堿的鹽）和酸性染料（色酸的鹽）配制而成。其中染色劑的分子很大，所以往往水中溶解度較低，需用酒精做溶劑。血液學中的血液涂片經常使用的瑞氏染色劑及姬姆薩染色劑就是這種混合染色劑。其中的各種不同成分可分剔使核、胞漿和顆粒著色。第四節 常用染色劑及配制供組織學診斷用的優秀常規染色劑，不僅須使細胞核和細胞漿有選擇性著染，也要使結締組織著色。蘇木素-伊紅染色的切片適當分色，可使這些結構得以區分，胞核表現為藍色，胞漿和結締組織纖維呈各種色調的粉紅，因此這是一種最常用的常規染色劑。一、蘇木素-伊紅

19、染色的基本原理蘇木素是最早用于生物學上的天然染色劑之一，百余年來，一直是生物學實驗室最常用的組織學中細胞核的染料，它是從蘇木樹的樹心中提煉出來的，為淺褐色結晶或淡黃褐色的粉末狀物。易溶于乙醇、甘油，也可溶于熱水。蘇木素本身沒有染色能力，它經過氧化后，能產生具有染色能力的蘇木紅，蘇木紅又稱為氧化蘇木素或蘇木因。蘇木素變成蘇木紅的過程叫作“成熟”。成熟的方法一般有兩種：一種是把配制好的蘇木素液在開口瓶中放置兩個月以上，讓其在日光和空氣中的氧的作用下使之氧化。故一般地盛蘇木素的瓶子放在向陽處，時間愈長，染色的效果愈好。常配制一大瓶，備長期使用。另一種方法是在蘇木素液中加入氧化劑，如磺酸鈉，過錳酸鉀，

20、氧化汞，雙氧水等。用這種方法成熟與用第一種方法者不同的是，它放置時間愈長，染色的效果愈低。這是因為蘇木紅被繼續氧化可生成無色的化合物，故一次不宜配制過多，還應放置40C冰箱內避光保存以延長使用時間。它的優點是配制后即可使用。成熟的蘇木素對組織并無親和力，須加入含金屬離子的媒染劑，才能達到染色的目的。一般用于明礬蘇木素的媒染劑為鉀明礬或氨明礬。主要是利用明礬中的鋁離子和蘇木紅結合形成的鋁沉淀色素為紫藍色，對染色質有很大的親和力，水和酒精都不能使其褪色。用于鐵蘇木素的媒染劑是三價鐵離子，蘇木紅的鐵沉淀色素為黑藍色，不溶于水，因此，故不能配制大量含媒染劑的混合液，一般用時現配，或在染色過程中，先用鐵

21、明礬媒染，然后再染蘇木素，如磷鎢酸蘇木素染色即是。常規蘇木素染色的對比染色是用伊紅，也有采用焰紅，因為焰紅比伊紅色澤更鮮明，此外還有采用橘黃G，比布里希猩紅，波爾多紅等作為對比染色。蘇木素-伊紅染色，在組織病理學中，是一種日常使用最為廣泛的常規染色方法。一張優質的染色切片，可以清晰地觀察到各種不同的組織結構以此作為病理診斷的確切依據。再根據此染色切片所見，分別進行不同的特殊染色。二、染液的配制在實驗室內常用的蘇木素染液有以下幾種，不同的僅是染色時間以及比較每種染色方法彼此的優缺點，不過各有優劣。（一）蘇木素染液的配制方法如下1.Harris氏蘇木素液甲液：蘇木素 1g 無水酒精 10ml乙液：

22、硫酸鋁鉀 20g 蒸餾水 200ml丙液：一氧化汞 0.5g經典的配制方法是，先將甲液加熱溶解后，密封待用，再將乙液加熱溶解至沸，去火，待溶液仍處于小沸騰狀態時再將甲液徐徐傾入其中，全部混合后，再使溶液在短時間內加熱至沸騰，去火，最后，將氧化汞緩慢傾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁。因氧化汞倒入后，溶液會迅速膨脹易沸出容器外而發生危險。）此時液體變為深紫色，待氧化汞全部放入后，再將溶液加溫至沸騰片刻，立即將溶液放入流動的冷水中，并緩緩地連續搖晃至溶液完全冷卻為止。隔夜后過濾，加入冰醋酸（按5%比例）混勻，再過濾后保存于冰箱內備用。我們在實驗工作中摸索了一種Harris氏蘇木素的

23、配制方法，染色效果很好，特介紹如下。配方：（配制2000ml） 蘇木素 9g 硫酸鋁胺（銨明礬） 200g 氧化汞 7g（510g）冰醋酸 100ml蒸餾水 2000ml器具： 3000毫升三角燒瓶 1個 200毫升量筒 1個 1000毫升量筒 1個 漏斗 1個（大） 濾紙 1大張另備脫脂棉、電爐、濕抹布、大稱量紙、流水槽等。（器具要求達到化學潔凈）配法：1將蘇木素溶于100毫升無水乙醇中，密封備用。2將200克銨明礬溶于2000毫升蒸餾水中，加熱至沸。3去火。加入蘇木素酒精攪拌，加熱至沸。4去火。緩緩加入氧化汞。5微火煮至有金屬膜產生。6去火。以濕抹布包住三角燒瓶的頸部。迅速放置于冷水浴中冷

24、卻，緩緩搖動燒瓶至液體完全冷卻為止。7靜置避光過夜。棉花過濾。濾液中加入冰醋酸（按5%的比例加入），混勻，濾紙過濾，備用。注意事項：1配制好的蘇木素液，未經使用的可長期置冰箱（冷藏）內保存。2盛液體的燒瓶要質優并且容積要大，防止忽速冷卻對破裂和煮沸時液體溢出。2.Hansen氏蘇木素液甲液：蘇木素1g無水酒精10ml乙液：硫酸鋁鉀（鉀明礬） 20g蒸餾水200ml丙液：高錳酸鉀1g蒸餾水16ml先將甲液加熱溶解，然后將乙液加熱溶解，將甲、乙兩液混合。再將丙液溶解后緩緩滴入，待全部混合后，再次煮沸一分鐘，冷卻后過濾，即可使用。3.Heidenhain氏鐵蘇木素液甲液：硫酸鐵銨（紫色結晶）5g蒸餾

25、水100ml乙液：蘇木素0.5g無水酒精10ml蒸餾水90ml此液要求硫酸鐵銨只有紫色的透明結晶才能使用；蘇木素是溶于灑精中然后加水。蘇木素液需放置4-5周才能成熟。臨用時將甲、乙兩液等量混合后使用。（也可先將蘇木素用無水酒精配成5%的貯備成熟，用時取10毫升加蒸餾水至100毫升使成乙液）此蘇木素液能染許多結構，但只能用于退行性染色法，需要熟練的分化，初學者宜用減半濃度的鐵明礬分色，熟悉后再用原濃度分色。此液與其它的蘇木素染色技術有兩個不同a.媒染劑與蘇木素分開使用。b.所用的媒染劑亦用作為分色劑。4Ehrilich氏酸性蘇木素液主要應用一般染色和粘液，骨組織的染色配方： 蘇木素 2g 純酒精

26、 100ml 甘油 100ml 蒸餾水 100ml 冰醋酸 10ml 鉀明礬 15g 將蘇木素溶于純酒精，再將鉀明礬溶于蒸餾水中，溶解后將甘油傾人混合，然后加入蘇木素酒精混合，最后加人冰醋酸，溶液全部混合后，應暴露在日光下使其自然成熟，時間約要三個月。（若加人300毫克碘酸鈉，使蘇木素迅速氧化則可立即使用。）此液貯存愈久染色力愈強。（可保持數年之久）染色時間520分鐘，結果甚佳。5Delafreld氏蘇木素液主要應用于一般染色，彈力纖維的染色。甲液： 蘇木素 4g 純酒精 25ml乙液： 飽和銨明礬水溶液（約 10）40毫升丙液： 甘 油 100ml 甲 醇 100ml 先將蘇木素溶于酒精，再

27、將甲液混合在乙液中，置于白色瓶中并暴露在陽光下約一周，然后過濾，將丙液加人濾液中，待溶液呈暗灰色時再過濾，濾液密封保存。6Mayer氏明礬蘇木素液主要應用于一般染色，骨組織染色，及免疫組化染色。配方： 蘇木素 0.1g 鉀明礬 5g 碘酸鈉 0.02g 拘椽酸 0.1g 水合氯醛 5g 蒸餾水 100ml 先將蘇木素及水煮沸溶解，加人鉀明礬與碘酸鈉，攪動直到全部溶解為止。再加人水合氯醛和拘椽酸，完全溶解后染液呈藍紫色。加熱煮沸五分鐘，冷卻后過濾即成。 此染液染切片515分鐘，不需分化，充分水洗后，可使細胞核顯藍色并且非常細致清晰，通常用于對比染色。7Weigert氏鐵蘇木素液甲液 蘇木素 1g

28、 無水酒精（或 95酒精） 100ml乙液 29三氯化鐵水溶液 4ml 蒸餾水 95ml 鹽酸 1ml 臨用時，取甲、乙液等量混合即可應用。混合時應將乙液加人甲液內，染液呈紫黑色。鐵蘇木素不能象明礬蘇木素一樣配制后可放置貯存備用，因鐵與染色劑的色素根會化合生成不溶性沉淀，所以鐵作媒染液時，必須與染液分別配制和分別保存，染片時臨時混合應用。 由于這是一種鐵蘇木素，它將胞核染成黑色。能抵抗在對比染色液中所含分色劑的脫色作用，且不會被光線退色，因此比鉀礬蘇木素染色較為持久。8Mallory氏磷鎢酸蘇木素液（PTAH）配方： 蘇木素 0.1g 磷鎢酸 2.0g 蒸餾水 100ml 將蘇木素于20毫升蒸

29、餾水中加熱溶解，再將磷鎢酸溶于80毫升蒸餾水。蘇木素液冷卻后加人磷鎢酸溶液中混合，置放人有陽光處數星期至數月才成熟。此液可久放，若急用時可加人0177克高錳酸鉀促其成熟。 該染色劑對神經組織及纖維素是一種較為卓越的染色劑。9Mallory氏磷鉬酸蘇木素液 蘇木素 1g 10磷鉬酸水溶液 10ml 水合三氯乙醛 610g 蒸餾水 100ml 暴露于陽光下氧化一周，用時過濾。此染色劑主用于中樞神經系統的染色。10Bohmer氏蘇木素液 蘇木素 1g 純酒精 10ml 鉀明礬 20g 蒸餾水 200ml 將蘇木素溶于酒精稍加溫。鉀明礬溶于蒸餾水，兩液混合置燒杯或廣口瓶中，以紗布或棉花封蓋，在陽光下約

30、l2個月自然成熟的蘇木素液面可見一層金屬膜樣物。組織切片染色用510分鐘，以鹽酸酒精分化。（二）分化液 1鹽酸酒精，是最常用的分化液。 配方： 70酒精 99ml 濃鹽酸 1ml（三）還原液 1氫氧化氨液： 配方： 濃氨水 1ml 蒸餾水 99ml 2飽和碳酸鋰液： 配制： 碳酸鋰 1g 蒸餾水（冷） 78ml 3流水沖洗還原。（四）伊紅染液 伊紅為磚紅色粉末狀或醬紅色結晶，是最常用的胞漿染料。又名為曙紅，它是螢光黃的四溴衍生物。曙紅本身溶于醇而不溶于水，也稱為醇溶性伊紅，它的鈉鹽，鉀鹽或銨鹽可溶于水，因此稱為水溶性伊紅。 配方： 伊紅Y（水溶） 0.5lg 蒸餾水 99ml若取用伊紅Y（醇溶

31、性）應溶于99ml75或95的乙醇中。若在伊紅液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色過程，并使胞漿的色澤更為艷麗。第五節 蘇木素一伊紅染色法 蘇木素、伊紅染色，簡稱HE染色，是組織學技術的常規染色方法。恒定優質HE切片應該是紅藍相映，層次濃淡均為分明。 一、石蠟切片蘇木素一伊紅染色法的基本步驟：脫蠟 （1）二甲苯I 15分鐘 （2）二甲苯II（應完全透明） 10分鐘逐級降濃度酒精水化（3）無水酒精I（變為不透明） 12分鐘（4）無水酒精II 12分鐘（5）95% 酒精 12分鐘 （6）80% 酒精 12分鐘 （7）自來水洗 片刻染色 （8）蒸餾水 片刻 （9）蘇木素液染核 1015分鐘 （10

32、）自來水洗 片刻 （11）1%鹽酸酒精分化 0.51分鐘 （12）流水沖洗 片刻至數小時 （13）碳酸鋰飽和水溶液反藍 1分鐘 （14）流水沖洗 15分鐘至數小時 （15）復染 05伊紅水溶液（對比染色） 25分鐘逐級升濃度酒精脫水（若為醇溶伊紅可直接人90酒精） （16）自來水洗（分化伊紅） 片刻 （17）95酒精I 12分鐘 （18）95%酒精 II I2分鐘 （I9）無水酒精 I 12分鐘 （20）無水酒精II l2分鐘透明 （21）二甲苯I 510分鐘 （22）二甲苯II 510分鐘 可作透明度試驗：在黑色背景下以光線照于切片如果見有乳白色斑片系脫水不足，需再行脫水。封固 （23）蓋玻

33、片下封固 結果：胞核呈藍色，胞漿呈紅色，紅細胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色。 二、染色過程中的加熱 為了縮短某些程度的染色時間，通常可用加熱的方法來實現。一般是將切片或涂片浸在染色液內，連同染色皿置于37或56溫箱內至所需時間。 有的染色需用煮沸或近于煮沸的技術，可將染色液在試管內煮沸后傾在載玻片上；或在注滿染液的載玻片下面直接加熱，直接加熱會因溶劑蒸發而使染色劑發生沉淀。這可在傾人染色劑以前在切片上覆蓋一塊方形濾紙束加以防止。染色完成后沖洗切片時可以很容易地除掉濾紙而又不會損傷切片。 三、染色時應注意事項 一張優質的HE染色切片，絕非僅指染色而言，它包括很多方面，首先應重視“固定”環節，

34、其次注意脫水、透明、組織浸蠟，包埋和切片等各個步驟。一張因固定、脫水等步驟有所缺陷的切片，染色是不可能鮮艷、透明、層次分明的。解決上述各細節問題的方法已在前面各章節中均提到過。但在進行HE染色時還應注意以下問題： 1組織切片的脫蠟步驟應徹底，否則無論進行那種染色都會發生困難。脫蠟時間要充分，若溶蠟劑使用過久應及時更換以免效率降低，若室溫過低，可將溶蠟劑置于溫箱中進行脫蠟。 2蘇木素染液使用一段時間后表面易出現亮晶狀飄浮物，這可能是液體表面的過氧化物，必須過濾除去，以防沉渣污染組織切片。蘇木素液一般染過三、四百張切片后，著色力會減弱，著色不鮮艷，呈灰藍色時應及時更換新液。 3染色的時間長短需依據

35、：染劑對組織的染色作用，室溫條件，切片厚薄，固定液的類別，染液的新舊而進行調節。所以在染色時必須使用顯微鏡觀察染色程度以利掌握時間。 4分化十分重要。分化步驟的準確也是染色成敗的關鍵，若分化失當則必然引起染色不勻或過淡，過深等現象，因此分化后一定要鏡檢，觀察胞核是否清晰，胞漿呈淡白色。否則需再次分化，不然一旦復染后，組織會呈紫藍色即“藍蓋紅”現象。5還原液不宜過濃，若堿性太強易使組織脫落故以淡為宜。6伊紅宜淡染，復染過深胞核會不清晰，影響鏡檢。7若脫水，透明等步驟不夠徹底，則組織表面會有一層霧狀膜。若有這一現象，應立即更換純酒精脫水，再次透明。在潮濕的季節里應注意酒精的濃度、若降低要及時更換。

36、8染色后的組織切片、要將組織四周的污染物痕跡擦掉，以免影響美觀。9封固劑要適量，滴加時應小心傾滴，蓋玻片要輕輕放置，以免氣泡產生影響鏡檢。蓋玻片大小選擇要合適，一般要大于組織塊，以防封蓋不全，蓋玻片要放正，標簽貼牢，編號清楚。從而保證切片的封藏和美觀。 10染好的切片應妥為保存，更應避免日光照射，否則切片容易褪色。 第六節 封固劑由于組織學制片需隨時檢查或保存，故要在蓋玻片下封固。封固劑又稱婊媒，顧名思義，它既能使染色后的組織封固于載玻片和蓋玻片之間，不使直接與空氣接觸，避免氧化褪色。另一方面使組織切片在封固劑的充實下，其折光率能和玻片的折光率相近，從而獲得清晰的鏡檢效果。（玻片折光率為151

37、8）封固切片的介質需根據多種因素而定。常用的有兩類：1含水封固劑：如甘油，甘油明膠和 Apath糖漿等，用于未染色的材料，脂肪染色，異染染色等。如：甘油明膠常用于脂肪染色的冰凍切片Apath糖漿則用于證明淀粉樣變的結晶染色法中。此類封固劑使用方便，組織切片不必經過脫水、透明等步驟即可封固。但切片仍可以久存。2無水封固劑：如中性樹膠，大馬樹脂及人工樹脂等。用于石蠟，冰凍和火棉膠切片的封固，使用時組織切片必須脫水，透明徹底，不然片中會出現云霧狀混濁，妨礙鏡檢。通常這些封固劑系將一種樹脂（天然或合成的）溶于其天然溶劑或二甲苯內直至呈適當的易干易凝的流體狀以便封固。其粘稠度以便易排除氣泡且在蓋玻片與切

38、片之間能自由流動為好，稍稠一點則可避免干燥后在蓋玻片下形成空氣間隙。選擇一種封固劑，應以對所用的各種染色劑不褪色為原則。如：用堿性苯胺染料染色需封固于不含酸的封固劑內。象普魯士藍反應的切片應封固于非還原性封固劑內。封固劑還應具有準確的折光率：未染色組織最好用有很高或很低折光率的封固劑封固。而染色的切片則以折光率在152至154之間的封固劑封固則透明度最佳。我們常用的無水封固劑為市售的中性二甲苯樹膠液，亦稱中性樹膠；為無色或淡黃色的透明液體，因酸或堿性封固劑均可引起組織切片的褪色，故宜用中性封固劑。封固劑應保存于有色瓶中避免日光照射，并存放于暗處以防酸變。 中性樹膠是很好的封固劑，不僅折光率（1

39、52）及色散作用都近似于玻璃，而且在很薄一層時幾乎是完全無色透明。用以封存HE染色的切片則色彩非常鮮艷。干固后即變硬，能把蓋玻片和載玻片緊緊地粘在一起。僅有的缺點是隨著保存時間的延長，樹膠逐漸使二甲苯氧化，產生甲苯酸及鄰苯二甲酸能使堿性染料褪色。 第一篇 免疫組織化學技術及親和免疫組織化學技術第一章 免疫組織化學技術 第一節 基本原理免疫組織化學技術是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，對組織或細胞內抗原或抗體物質定性和定位的組織化學技術。免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法，免疫鐵蛋白法。免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現代

40、生物學和醫學中廣泛應用的方法之一，包括熒光抗體和熒光抗原技術，具有抗原抗體反應的特異性，染色技術的快速性，在細胞或組織上定位的準確性，以及熒光效應的靈敏性等優勢。但是，由于免疫熒光法必須具有熒光顯微鏡，熒光強度隨時間的延長而逐漸消退，結果不易長期保存等缺點，在普及應用上受到一定限制，而逐漸被免疫酶法所取代。 一、免疫熒光法免疫熒光法的基本原理是將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素，當與其相對應的抗原或抗體起反應時，在形成的復合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見發出熒光的抗原抗體結合部位，檢測出抗原或抗體。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（fluorecein isothiocyant

41、e，FITC），為黃色、橙黃色或褐黃色結晶粉末，有兩種異構體，易溶于水和酒精等溶劑。分子量為389，最大吸收光譜為490495，最大發射光譜為520530urn，呈現明亮的黃綠色熒光，是最常用的標記抗體的熒光素。四甲基異氰酸羅達明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC）是一種紫紅色粉末，較穩定，是羅達明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光譜550urn，最大發射光譜620urn呈橙紅色熒光，與FITC發射的黃綠色熒光對比鮮明，常用于雙標記染色。按照抗原抗體反應的結合步聚，免疫熒光法可分為以下三種。1直接法用熒光素標記的特異性抗體直接與相應的抗

42、原結合，以檢查出相應的抗原成分。2間接法先用特異性抗體與相應的抗原結合，洗去未結合的抗體，再用熒光素標記的抗特異性抗體（間接熒光抗體）與特異性抗體相結合，形成抗原一特異性抗體一間接熒光抗體的復合物。在此復合物上帶有比直接法更多的熒光抗體，所以，此法較直接法靈敏。3補體法用特異性的抗體和補體的混合液與標本上的抗原反應，補體就結合在抗原抗體復合物上，再用抗補體的熒光抗體與之相結合，就形成了抗原一抗體一補體一抗補體熒光抗體的復合物。熒光顯微鏡下所見到的發出熒光的部分即是抗原所在的部位。補體法具有敏感性強的優勢，同時適用于各種不同種屬來源的特異性抗體的標記顯示，在各種不同種屬動物抗體的檢測上為最常用的

43、技術方法。4雙重免疫熒光法在對同一組織細胞標本上需要檢測兩種抗原時，可進行雙重熒光染色，即將兩種特異性抗體（例如抗A和抗B）分別以發出不同顏色的熒光素進行標記，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記發出黃綠色熒光，抗B抗體用四甲基異硫氰酸羅明達標記發出橙紅色熒光，將兩將熒光抗體按適當比例混合后，加在標本上（直接法）就分別形成抗原抗體復合物，發出黃綠色熒光的即抗A抗體結合部位，發出橙紅色熒光的即抗B抗體結合的部位，這樣就明確顯示兩種抗原的定位。二、免疫酶法免疫酶法是借助酶細胞化學等手段顯示組織抗原（或抗體）的新技術，是在免疫熒光法的基礎上發展起來的。已如前述，免疫熒光法具有操作簡便、靈敏、特異性高、省時的

44、優勢，但同時也具有令人遺憾的不足，特別是熒光標本不能長期保存以及需要價格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的問題。為此，Nakane等人（1966）嘗試了用酶代替熒光素來標記抗體的方法，從而成功地開創了酶標記抗體的新技術（酶標抗體法）。Sternbenger等人又將非標記抗體過氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的進步，成為當今使用最為廣泛的免疫組織化學技術。 免疫酶法與免疫熒光法相比較，具有以下優點：酶反應產物呈現的顏色不僅能在一般的普通生物顯微鏡下觀察，而且其產物因具有一定的電子密度也可在電鏡下觀察（免疫電鏡技術），光鏡與電鏡的結合，使靈敏度進一步提高，標本又能長期保存，并能加設HE染色等其他復

45、染，有利于將被檢測物質與病變的形態學改變聯系起來（定性與定位），彌補了免疫熒光法的不足。 免疫酶法的基本原理與免疫熒光法有所相似，免疫酶法是將酶以共價鍵的形式結合在抗體上，制成酶標抗體，再借助酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面或細胞內部各種抗原成分的定位。 從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體進行免疫酶法染色，但實際上能用于免疫組織化學技術的酶并不多。sternbenger等人指出：用于標記的酶應具備以下六點： 1酶催化的底物必需是特異的，而且容易被顯示，即催化反應所形成的產物易于在光鏡和電鏡下觀察。 2酶反應的終

46、產物所形成的沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學定位。 3較易獲得純的酶分子。 4中性PH值時，酶分子應穩定。 5在酶標過程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性。 6被檢組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似的物質，否則結果將難以判定。 上述六點中以12兩點最為重要，因為并非所有的容易顯示的酶均能形成不溶性的復合物。符合上述要求的，最為常用的酶是辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，H：flJ）。其次是堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP），除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD

47、）等，但因其形成的不溶性色素擴散作用較大，在應用上受到很大限制。 HRP廣泛分布于植物界，因其辣根含量最高而得名。它是由無色酶蛋白和深棕色的鐵葉結合組成的一種糖蛋白（糖占 18左右），分子量為 40，000道爾頓，等電點39，最適 PH為 5.0左右。HRP易溶于水和 58以下的飽和硫酸鉸溶液，其活性部分為鐵葉琳，稱輔基。酶的蛋白部分無活性。酶蛋白和鐵葉琳輔基的最大吸收光譜分別為275urn和403urn；HRP的純度用兩者的光密度比值（M03人工衛75）來衡量，以RZ（Reinheitzahi）來表示。一般認為，標記酶的 RZ值為 3.0左右，不應2.8，RZ值越小，酶的純度越差，對于純度低

48、，質量差的酶，需經純化后才能使用。 AKP是一種磷酸酶的水解酶，磷酸單酯酶對于連接于作用物磷酸基上的醇基沒有特異性，因它可以水解多種有機磷酸酯，生成醇和磷酸鹽離子。該酶在許多人體組織或動物組織中有分布，如肝、胎盤、白細胞、腎、小腸等。AKP的分子量為80KD，最適PH為9.8，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響，如用二乙醇胺緩沖液（1molL，PHg8）對AICI具有活化作用，酶的活性高，而用甘氨酸一NaOH緩沖液則對AKP有抑制作用。AKP的活化劑有鎂和錳離子，Mg+的適應濃度為10mol/L。甘氨酸、檸檬酸鹽，EDTA等對 AKP有抑制作用。AKP對溫度具有較高的敏感性，從

49、25增加到 35，其催化反應速度增加 1.5倍。當選用不同的底物時，AKP可催化形成不同顏色的終產物。例如，萘酚一AS一MX和快藍（Fast blue，Fh）為底物時生成藍色產物，可與HRP催化的產物形成鮮明的對比，用快紅（Fast red）代替快藍則生成紅色不溶性產物，而且內源性AKP較易清除，可以較好地避免內源性酶的干擾，使其具備了某些獨特的優點而日益備受重視。 GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基藍四隆（Paranitroblue Tetrazolium），終產物比較穩定，為不溶性的藍色沉淀。從理論上講，GOD較AKP和HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性葡萄糖氧化酶，這樣可以很好地避免內源性酶的干擾。但是，GOD的分子較HRP大三倍，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，而影響酶的活性。 免疫酶法與免疫熒光法大致相同，也可以分為以下幾種。 1直接法 用酶標記的特異性抗體直接與標本中的相應抗原反應結合，再與酶的底物