酶類藥物分析_第1頁
酶類藥物分析_第2頁
酶類藥物分析_第3頁
酶類藥物分析_第4頁
酶類藥物分析_第5頁
已閱讀5頁,還剩91頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、1酶類藥物的分析酶類藥物的分析第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查酶類藥物的鑒別與檢查第三節(jié)第三節(jié) 酶活力測定方法酶活力測定方法第四節(jié)第四節(jié) 酶活力測定方法設計酶活力測定方法設計第五節(jié)第五節(jié) 典型酶類藥物的檢測典型酶類藥物的檢測2。品種來源劑型類別門冬酰胺酶(埃希)大腸埃希菌提取粉劑抗腫瘤藥注射用門冬酰胺酶(埃希)門冬酰胺酶(埃希)凍干粉劑抗腫瘤藥門冬酰胺酶(歐文)歐文菌提取粉劑抗腫瘤藥注射用門冬酰胺酶(歐文)門冬酰胺酶(歐文)凍干粉劑抗腫瘤藥抑肽酶牛胰、牛肺提取粉劑蛋白酶抑制劑注射用抑肽酶抑肽酶凍干粉劑蛋白酶抑制劑尿激酶新鮮人尿提取粉劑溶栓藥注射用尿激酶尿激酶凍干粉劑溶栓

2、藥細胞色素C溶液豬心、牛心提取溶液細胞代謝改善藥細胞色素C注射劑細胞色素C注射劑細胞代謝改善藥注射用細胞色素C細胞色素C凍干粉劑細胞代謝改善藥玻璃酸酶哺乳動物睪丸提取粉劑黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶凍干粉劑黏多糖分解酶胃蛋白酶豬、羊或牛的胃黏膜提取粉劑助消化藥胃蛋白酶片胃蛋白酶片劑助消化藥胃蛋白酶顆粒胃蛋白酶顆粒劑助消化藥含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉劑助消化藥胰蛋白酶豬、羊或牛胰中提取粉劑蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶凍干粉劑蛋白分解酶胰酶豬、羊或牛胰中提取的酶混合物粉劑助消化藥胰酶腸溶片胰酶片劑助消化藥胰酶腸溶膠囊胰酶膠囊劑助消化藥胰激肽原酶豬胰中提取粉劑血管舒張藥凝血酶凍干粉牛血或豬血中

3、提取的凝血酶原凍干粉劑局部止血藥糜蛋白酶牛或豬胰中提取粉劑蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶凍干粉劑蛋白分解酶3第一節(jié)第一節(jié) 概述概述n在生物體內,降低反應在生物體內,降低反應活化能活化能,加快可逆反應的進,加快可逆反應的進行速度。行速度。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分類二、酶的分類n三、酶的化學組成三、酶的化學組成n四、酶的催化反應機制四、酶的催化反應機制n五、酶催化反應動力學五、酶催化反應動力學4一、酶的特性一、酶的特性 1酶是高效催化劑。酶是高效催化劑。 n2酶對底物的結構具有嚴格的選擇性。酶對底物的結構具有嚴格的選擇性。 n(1)相對專一性:)相對專一性: 脂肪水解酶,蛋白水解酶

4、脂肪水解酶,蛋白水解酶n(2)絕對專一性)絕對專一性: 脲酶脲酶n(3)立體異構專一性)立體異構專一性: L-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶n3酶催化反應的反應條件溫和。酶催化反應的反應條件溫和。n4酶的催化活性在生物體內受多種因素的調節(jié)酶的催化活性在生物體內受多種因素的調節(jié)。5。56二、酶的分類二、酶的分類n氧化還原酶氧化還原酶n轉移酶轉移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n異構酶異構酶n合成酶(或稱連接酶)合成酶(或稱連接酶)7三、酶的化學組成三、酶的化學組成 n分為分為簡單酶和結合酶簡單酶和結合酶兩大類。兩大類。n結合酶類中除含有蛋白外,還含有某種熱穩(wěn)定結合酶類中除含有蛋白外,還含有某種熱穩(wěn)定的非

5、蛋白質的小分子物質,二者結合起來,稱的非蛋白質的小分子物質,二者結合起來,稱為為“全酶全酶”,才呈現(xiàn)生物催化活性。,才呈現(xiàn)生物催化活性。n結合酶結合酶 = 酶蛋白酶蛋白 + 輔助因子輔助因子8四、酶的催化反應機制四、酶的催化反應機制 n1酶酶-底物復合物的形成底物復合物的形成 在酶促反應中,反應在酶促反應中,反應底物首先與酶分子上活性部位結合,形成底物首先與酶分子上活性部位結合,形成酶酶-底底物復合物物復合物,降低反應的,降低反應的活性能活性能,使酶促反應順,使酶促反應順利進行。利進行。n2酶酶-底物復合物加速反應速率的原因底物復合物加速反應速率的原因n(1)定向作用與底物濃縮)定向作用與底物

6、濃縮 n(2)酶使底物分子變形)酶使底物分子變形 n(3)酸堿催化)酸堿催化n(4)共價催化)共價催化 。9五、酶催化反應動力學五、酶催化反應動力學 n酶的活力單位酶的活力單位 酶活性單位(酶活性單位(U)是酶活性)是酶活性高低的一種量度,用高低的一種量度,用U/g或或U/ml表示。表示。n酶活力單位定義:在規(guī)定的條件下,每分酶活力單位定義:在規(guī)定的條件下,每分鐘能轉化鐘能轉化1mol底物所需要的酶量,稱一底物所需要的酶量,稱一個酶的活力單位。個酶的活力單位。n酶的比活力酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力,每毫克酶蛋白所含酶活力,U/mg。 10Michaelis-MentenMichaeli

7、s-Menten快速平衡學說快速平衡學說n底物濃度的增加,反應底物濃度的增加,反應速度上升呈速度上升呈雙曲線雙曲線。n在在低底物濃度低底物濃度時,反應時,反應速度呈直線上升,表現(xiàn)速度呈直線上升,表現(xiàn)為為一級反應一級反應。n在高濃度時,反應速度在高濃度時,反應速度達到一個極限值,呈現(xiàn)達到一個極限值,呈現(xiàn)零級反應零級反應。11米氏方程米氏方程n酶反應動力學方程式:酶反應動力學方程式:nV反應初速度反應初速度nVm最大反應速度最大反應速度nKs 米氏常數,米氏常數,Ks=K1/K1, Ks為為ES的解離常數,的解離常數,表示酶與底物的親和力表示酶與底物的親和力。nKs為反應速度為反應速度V是最大反應

8、速度是最大反應速度Vm一半時所需底物濃一半時所需底物濃度,即度,即V=1/2 Vm時,時,Ks=S。12Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學說穩(wěn)態(tài)學說 nES的形成速度與的形成速度與ES的解離速度相等,達到的解離速度相等,達到動態(tài)平動態(tài)平衡衡,即,即“穩(wěn)態(tài)穩(wěn)態(tài)”,反應方程式:,反應方程式:nKm取代了取代了Ks,當當V=1/2 Vm時,時,Km=S。nKm也表示為底物與酶的親和力。也表示為底物與酶的親和力。132015版藥典收載的酶原料版藥典收載的酶原料n胰酶,胃蛋白酶胰酶,胃蛋白酶n胰蛋白酶,糜蛋白酶,玻璃酸酶胰蛋白酶,糜蛋白酶,玻璃酸酶n尿激酶尿激酶n抑肽酶,門冬酰胺酶抑肽酶,門冬酰胺酶品種

9、來源劑型類別門冬酰胺酶(埃希)大腸埃希菌提取粉劑抗腫瘤藥注射用門冬酰胺酶(埃希)門冬酰胺酶(埃希)凍干粉劑抗腫瘤藥門冬酰胺酶(歐文)歐文菌提取粉劑抗腫瘤藥注射用門冬酰胺酶(歐文)門冬酰胺酶(歐文)凍干粉劑抗腫瘤藥抑肽酶牛胰、牛肺提取粉劑蛋白酶抑制劑注射用抑肽酶抑肽酶凍干粉劑蛋白酶抑制劑尿激酶新鮮人尿提取粉劑溶栓藥注射用尿激酶尿激酶凍干粉劑溶栓藥細胞色素C溶液豬心、牛心提取溶液細胞代謝改善藥細胞色素C注射劑細胞色素C注射劑細胞代謝改善藥注射用細胞色素C細胞色素C凍干粉劑細胞代謝改善藥玻璃酸酶哺乳動物睪丸提取粉劑黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶凍干粉劑黏多糖分解酶胃蛋白酶豬、羊或牛的胃黏膜提取粉

10、劑助消化藥胃蛋白酶片胃蛋白酶片劑助消化藥胃蛋白酶顆粒胃蛋白酶顆粒劑助消化藥含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉劑助消化藥胰蛋白酶豬、羊或牛胰中提取粉劑蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶凍干粉劑蛋白分解酶胰酶豬、羊或牛胰中提取的酶混合物粉劑助消化藥胰酶腸溶片胰酶片劑助消化藥胰酶腸溶膠囊胰酶膠囊劑助消化藥胰激肽原酶豬胰中提取粉劑血管舒張藥凝血酶凍干粉牛血或豬血中提取的凝血酶原凍干粉劑局部止血藥糜蛋白酶?;蜇i胰中提取粉劑蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶凍干粉劑蛋白分解酶中國藥典中國藥典收載的酶類藥品品種收載的酶類藥品品種15第二節(jié)第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查酶類藥物的鑒別與檢查n鑒別方法鑒別方法: :n蛋白質鑒別方

11、法蛋白質鑒別方法,如在堿性條件下的雙縮脲反,如在堿性條件下的雙縮脲反應。應。nSDS-PAGESDS-PAGE電泳:降纖酶電泳:降纖酶nHPLCHPLC:門冬酰胺酶:門冬酰胺酶n專用于酶的鑒別方法:專用于酶的鑒別方法:n 酶活性試驗:與特異性底物反應(酶活性試驗:與特異性底物反應(胰蛋白酶胰蛋白酶)。)。n 沉淀試驗沉淀試驗:胃蛋白酶胃蛋白酶n 動物試驗:動物試驗:透明質酸酶透明質酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。 16酶類藥物的檢查酶類藥物的檢查 n酶類藥物是生化產品和微生物發(fā)酵產品,在酶類藥物是生化產品和微生物發(fā)酵產品,在生產過程中可能帶入微量的生產過程中可能帶入微量的脂肪類物質、其脂肪類物質、

12、其他的酶類和大分子雜質他的酶類和大分子雜質,影響酶質量,需有,影響酶質量,需有含量限度。含量限度。17酶類藥物的檢查酶類藥物的檢查n(一)脂肪含量限度檢查一)脂肪含量限度檢查n檢查方法,乙醚浸提,干燥,精密稱定,脂肪檢查方法,乙醚浸提,干燥,精密稱定,脂肪不得過規(guī)定的含量。不得過規(guī)定的含量。n(二)其他酶類含量限度檢查(二)其他酶類含量限度檢查n胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提取的蛋白分解酶。取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶時又易帶入微提取胰蛋白酶時又易帶入微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n(三)大分子活性物質含量限度檢查(三)大分子活性物質含量限度檢查

13、18胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶專屬水解糜蛋白酶專屬水解芳香氨基酸芳香氨基酸(L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸)苯丙氨酸)的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯(N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester,ATEE)作底物,通過)作底物,通過分光光度法測定此分光光度法測定此酶對底物的水解速率酶對底物的水解速率來檢查來檢查該酶的含量限度。該酶的含量限度。19第三節(jié)第三節(jié) 酶活力測定方法酶活力測

14、定方法n固定時間法固定時間法 n連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法 n固定濃度法固定濃度法 20一、固定時間法一、固定時間法 (終點法)(終點法)n在適宜的條件下,使酶和底物共同保溫在適宜的條件下,使酶和底物共同保溫一定一定時間時間,測定,測定產物生成的量產物生成的量或或底物消耗的量,底物消耗的量,計算出酶的含量(或活力)。計算出酶的含量(或活力)。n nE表示酶濃度,表示酶濃度,P為反應產物濃度,為反應產物濃度,t 表表示酶作用時間,示酶作用時間,K為常數。為常數。21實例:n(1)胰胰彈性蛋白酶彈性蛋白酶活力單位定義:在活力單位定義:在pH 8.8,37條件下作用條件下作用20min,水解,水解1.0m

15、g剛果紅彈性蛋白的酶量定義為一個活力單位。剛果紅彈性蛋白的酶量定義為一個活力單位。n n(2)天冬氨酸酶天冬氨酸酶活力活力單位定義:在測定條件單位定義:在測定條件下,每小時每克細胞轉化生成下,每小時每克細胞轉化生成1mol天冬氨天冬氨酸所需的酶量酸所需的酶量。 22注意事項注意事項n缺點:無法了解整個反應缺點:無法了解整個反應過程是否都是零級反應。過程是否都是零級反應。n注意事項:注意事項:n1、底物飽和、底物飽和n2、時間、時間23二、連續(xù)監(jiān)測法(反應速度法)二、連續(xù)監(jiān)測法(反應速度法)n在酶反應過程中,在酶反應過程中,連續(xù)記錄不同時間的底物消耗量連續(xù)記錄不同時間的底物消耗量或產物生成量或產

16、物生成量。 n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”,其本身無色,其本身無色,經經酶作用后釋放出有色的反應產物酶作用后釋放出有色的反應產物。根據反應過程。根據反應過程中吸收度增高速率,算出酶活力單位。中吸收度增高速率,算出酶活力單位。n測定時間測定時間.n例如:例如:n磷酸對硝基苯酚酯磷酸對硝基苯酚酯 對硝基苯酚對硝基苯酚n法法下文為中國藥典下文為中國藥典2012015 5版胰蛋白酶活力測定方法,請仔細閱讀,版胰蛋白酶活力測定方法,請仔細閱讀,并闡述此酶活力測定的原理?其酶活力測定方法屬于哪一種?并闡述此酶活力測定的原理?其酶活力測定方法屬于哪一種?胰蛋白酶作用位點有哪些

17、?寫出測定所用底物的英文縮寫?胰蛋白酶作用位點有哪些?寫出測定所用底物的英文縮寫?n 供試品的制備:精密稱取本品適量,用鹽酸(供試品的制備:精密稱取本品適量,用鹽酸(0.001mol/L0.001mol/L)制成每)制成每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶單位的溶液。胰蛋白酶單位的溶液。n底物溶液的制備:取底物溶液的制備:取N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg85.7mg,加水溶解使成,加水溶解使成100ml100ml,作為底物原液;底物溶液應在制成后,作為底物原液;底物溶液應在制成后2 2小時內使用。小時內使用。n測定法:取底物溶液測定法:取底

18、物溶液3.0ml3.0ml,加鹽酸溶液(,加鹽酸溶液(0.001ml/L0.001ml/L)0.2ml0.2ml,混勻,作為,混勻,作為空白,取供試品溶液空白,取供試品溶液0.2ml0.2ml加底物溶液(預熱至加底物溶液(預熱至25250.50.5)3.0ml3.0ml,立即計,立即計時并搖勻,使比色池內溫度保持在時并搖勻,使比色池內溫度保持在25250.50.5,照紫外可見分光光度法在,照紫外可見分光光度法在253nm253nm的波長處,每隔的波長處,每隔3030秒種讀取吸收度,共秒種讀取吸收度,共5 5分鐘。每分鐘。每3030秒鐘吸收度的變秒鐘吸收度的變化率應恒定在化率應恒定在0.0150

19、.0150.0180.018之間,呈線性關系的時間不得少于之間,呈線性關系的時間不得少于3 3分鐘。若不分鐘。若不符合上述要求,應調整供試品的溶液濃度,另行測定。以吸收度為縱坐標,符合上述要求,應調整供試品的溶液濃度,另行測定。以吸收度為縱坐標,時間為橫坐標做圖,取在時間為橫坐標做圖,取在3 3分鐘內成直線部分的吸收度,按下式計算。分鐘內成直線部分的吸收度,按下式計算。n式中式中 P P為每為每1mg1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數;供試樣品中胰蛋白酶的單位數;nA A1 1為直線上終止的吸收度;為直線上終止的吸收度;A A2 2為直線上開始的吸收度;為直線上開始的吸收度;nT T為為A A1

20、 1至至A A2 2讀數的時間(分);讀數的時間(分);W W為測定液中供試品的量;為測定液中供試品的量;n0.0030.003為上述條件下,吸收度每分鐘改變?yōu)樯鲜鰲l件下,吸收度每分鐘改變0.0030.003相當于一個胰蛋白酶單位。相當于一個胰蛋白酶單位。25三、固定濃度法三、固定濃度法 (fixed-concentration essay)n根據酶催化反應,使根據酶催化反應,使反應產物反應產物達到額定的濃達到額定的濃度時其度時其反應時間與酶濃度成反比反應時間與酶濃度成反比的原理進行的原理進行設計的。設計的。n P=KEtn以所需時間的倒數(以所需時間的倒數(1/t)對酶濃度作圖即)對酶濃度作

21、圖即可制備標準曲線。可制備標準曲線。n優(yōu)點:優(yōu)點:1、記錄時間。、記錄時間。2、準確、準確26第四節(jié)第四節(jié) 酶活性測定方法的設計酶活性測定方法的設計 n一、影響因素一、影響因素 n二、底物與產物的測定方法二、底物與產物的測定方法 n三、測定條件的選擇三、測定條件的選擇 27一、影響因素一、影響因素 n1、底物底物n2、pHn3、溫度溫度n4、酶濃度酶濃度n5、空白和對照空白和對照28底物底物n酶可以同時作用多個底物。酶可以同時作用多個底物。n以以Km最小者最小者作為此酶的生理底物。作為此酶的生理底物。n從從底物性質底物性質看,選用的底物最好在物理化學性質看,選用的底物最好在物理化學性質上與產物

22、不同,利于測定。上與產物不同,利于測定。n從底物濃度看,為不使酶反應受到它的控制,反從底物濃度看,為不使酶反應受到它的控制,反應系統(tǒng)應使用足夠高的應系統(tǒng)應使用足夠高的底物濃度底物濃度。29胰凝乳蛋白酶幾種底物的胰凝乳蛋白酶幾種底物的Km底物底物Km(mmol/L)N苯甲酰苯甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺2.5N甲酰甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺12.0N乙酰乙酰酪氨酰胺酪氨酰胺32.0甘氨酰甘氨酰酪氨酰胺酪氨酰胺122.030底物濃度對酶反應速度的影響底物濃度對酶反應速度的影響S/KmV/Vmax0.010.990.11.015010911009931pHn酶活力測定選用酶活力測定選用緩沖體系緩沖體系。n不同緩沖

23、液所受影響不同。不同緩沖液所受影響不同。磷酸鹽磷酸鹽所受影響較所受影響較小,而小,而Tris則受影響較大。則受影響較大。n酶溶液用量與底物溶液比例不超過酶溶液用量與底物溶液比例不超過10為宜。為宜。32溫度溫度n溫度變化溫度變化1 ,反應速度可能相差,反應速度可能相差10以上以上,控制在控制在 0.1 。n反應溫度一般為反應溫度一般為25 ,此時酶不易滅活,此時酶不易滅活,Km較小,可以使用較低的底物濃度。較小,可以使用較低的底物濃度。n有些酶在有些酶在37 不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。33酶濃度酶濃度n酶樣要充分稀釋酶樣要充分稀釋。n取取3個不同酶量測得的個不同酶量測得的產物量產物量和和酶濃度酶濃度之間

24、為正比關系,這之間為正比關系,這樣的酶濃度范圍就是適當的。樣的酶濃度范圍就是適當的。34空白和對照空白和對照n空白:指雜質反應或自發(fā)反應引起的變空白:指雜質反應或自發(fā)反應引起的變化量,代表未知因素的影響?;浚砦粗蛩氐挠绊憽分為分為完全空白完全空白(如測定時要終止反應,(如測定時要終止反應,則空白可先加終止反應試劑再加酶)。則空白可先加終止反應試劑再加酶)。n酶空白酶空白n底物空白底物空白35二、底物與產物的測定方法二、底物與產物的測定方法 (酶反應的檢(酶反應的檢測方法)測方法) 1、化學方法化學方法:用化學法測定其中某一底物或產物的變化值。:用化學法測定其中某一底物或產物的變化值。

25、n2、分光光度法分光光度法: 常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、熒光測定法:熒光測定法: 簡單、靈敏、快速。簡單、靈敏、快速。n4、電化學分析法電化學分析法n(1) 離子選擇性電極分析法離子選擇性電極分析法n(2) 微電流法微電流法n5、其他方法其他方法n如測定氣體的測壓法,測定產物旋光度變化值的旋光測定法。如測定氣體的測壓法,測定產物旋光度變化值的旋光測定法。 酶活力測定反應的檢測方法酶活力測定反應的檢測方法按照酶法分析方法測定酶活性時,需要跟蹤酶促反應中按照酶法分析方法測定酶活性時,需要跟蹤酶促反應中某一反應底物或產物的濃度隨時間發(fā)生的變化量(速度某一反應

26、底物或產物的濃度隨時間發(fā)生的變化量(速度法),或測量酶促反應中反應產物或底物濃度的總變化法),或測量酶促反應中反應產物或底物濃度的總變化量(終點法)??舍槍δ承┮子跍y定的酶促反應底物或量(終點法)。可針對某些易于測定的酶促反應底物或產物選擇具體的檢測方法,包括容量分析法、氣體檢測產物選擇具體的檢測方法,包括容量分析法、氣體檢測法、光學檢測法、黏度測定法、酶聯(lián)免疫法等。法、光學檢測法、黏度測定法、酶聯(lián)免疫法等。 分光光度法分光光度法 若酶促反應中,反應底物或產物之一由于化若酶促反應中,反應底物或產物之一由于化學結構的改變,其吸光度的強度發(fā)生變化,可以通過測學結構的改變,其吸光度的強度發(fā)生變化,可

27、以通過測定該酶促反應系統(tǒng)的光吸收度的變化量,推算出酶的活定該酶促反應系統(tǒng)的光吸收度的變化量,推算出酶的活力。多數酶類藥物的含量檢測(效價測定)均采用分光力。多數酶類藥物的含量檢測(效價測定)均采用分光光度法,如胃蛋白酶、糜蛋白酶、門冬酰胺酶、溶菌酶光度法,如胃蛋白酶、糜蛋白酶、門冬酰胺酶、溶菌酶等。等。37三、測定條件的選擇三、測定條件的選擇 n1、單因素選擇單因素選擇n2 2、正交設計、正交設計多因素選擇多因素選擇381、單因素選擇比色法測溶菌酶活性單因素選擇比色法測溶菌酶活性n以染料艷紅以染料艷紅K-2BP標記標記的的MLysodeikticus為為底物底物,分解后產生游離,分解后產生游離

28、染色碎片(產物)染色碎片(產物)n離心除去未分解底物,離心除去未分解底物,上清液比色上清液比色n吸收度為溶菌酶活力的吸收度為溶菌酶活力的函數函數。39測定條件選擇測定條件選擇S pHn(1)酶反應)酶反應底物濃度底物濃度曲線曲線n以染料標記的以染料標記的MLysodeikticus為底物,酶量為為底物,酶量為20g時,時,1%底物濃度已接近使酶飽和。底物濃度已接近使酶飽和。n(2)酶反應)酶反應PH曲線曲線n磷酸緩沖液和檸檬酸磷酸緩沖液和檸檬酸磷酸緩沖磷酸緩沖液。液。n不同組分的緩沖液,其最適不同組分的緩沖液,其最適PH稍有不同,選用稍有不同,選用pH6.5磷酸緩沖磷酸緩沖液。液。40測定條件

29、選擇離子強度測定條件選擇離子強度 、反應時間及、反應時間及En(3)離子強度離子強度對酶反應的影響對酶反應的影響n離子強度在離子強度在0.3mol/L以上為宜,以上為宜,選用選用0.5mol/L。n(4)酶反應過程曲線)酶反應過程曲線(反應時反應時間間)和和酶濃度酶濃度曲線曲線n酶量為酶量為20 g時,反應在時,反應在30分分鐘以內,吸收度與反應時間有鐘以內,吸收度與反應時間有良好的線性關系,測定系統(tǒng)選良好的線性關系,測定系統(tǒng)選用用15分鐘分鐘。n酶量在酶量在50g之內之內,吸收度與酶,吸收度與酶濃度具有線性關系。濃度具有線性關系。41測定條件測定條件n1%染色菌體染色菌體緩沖液緩沖液1mln

30、37水浴保溫約水浴保溫約5分鐘分鐘n加加酶試樣酶試樣0.5ml準確反應準確反應15分鐘分鐘n加入酸加入酸/乳化劑混合液乳化劑混合液2ml,終止反應,反,終止反應,反應液經離心,上清液于應液經離心,上清液于540nm比色,所得比色,所得吸收度從酶濃度標準曲線即可查出試樣中吸收度從酶濃度標準曲線即可查出試樣中溶菌酶含量。溶菌酶含量。42二、正交設計多因素選擇二、正交設計多因素選擇n正交試驗設計(正交試驗設計(Orthogonal experimental design)是一種高效的)是一種高效的利用正交表來安排多利用正交表來安排多因素多水平設計試驗因素多水平設計試驗的方法。的方法。n通過巧妙的安排

31、和分組,通過巧妙的安排和分組,用較少的試驗次數,用較少的試驗次數,就能就能分析各因素的作用大小分析各因素的作用大小,找出最佳的試驗,找出最佳的試驗條件。條件。n利用各因素所對應指標的利用各因素所對應指標的極差極差R及平均極差及平均極差D作出判斷。作出判斷。43正交試驗優(yōu)選中性蛋白酶活力測定條件正交試驗優(yōu)選中性蛋白酶活力測定條件n中性蛋白酶是一種中性蛋白酶是一種蛋白水解酶蛋白水解酶,活力測定以,活力測定以酪蛋酪蛋白為底物白為底物,水解產物與福林試劑在堿性情況下反,水解產物與福林試劑在堿性情況下反應生成有色物質,于應生成有色物質,于680nm處測定吸收值處測定吸收值。n中性蛋白酶作用受中性蛋白酶作

32、用受緩沖液的緩沖液的pH值、底物濃度、值、底物濃度、反應時間反應時間及及酶濃度酶濃度等因素的影響。等因素的影響。n供試品:供試品:0.01%的中性蛋白酶溶液。的中性蛋白酶溶液。n底物:酪蛋白底物:酪蛋白44實驗方案實驗方案 n實驗取四個因素:實驗取四個因素: PH值、底物濃度、值、底物濃度、反應時間、酶濃度反應時間、酶濃度。n每個因素選三水平,屬于多因素多水平,每個因素選三水平,屬于多因素多水平,為此選用為此選用L9(34)正交表進行實驗。正交表進行實驗。 4546正交試驗表正交試驗表n 實驗號A緩沖液pH 值B底物濃度(%)C反應時間(min)D酶濃度(U/ml)11111212223133

33、342123522316231273132832139332147正交實驗安排表正交實驗安排表n n 48正交實驗安排表正交實驗安排表49各因素試驗值計算結果各因素試驗值計算結果 n平均極差越大,對應的因素影響越大。平均極差越大,對應的因素影響越大。n緩沖液緩沖液PH值值7.2,底物濃度,底物濃度0.5%,酶濃度用,酶濃度用100U/ml為最佳反應條件。為最佳反應條件。n反應時間為反應時間為10,20,30min,對,對OD值無顯著影響。值無顯著影響。50各因素試驗值的方差分析各因素試驗值的方差分析 結論:結論:PH值(值(A)、底物濃度(底物濃度(B)、酶濃度(酶濃度(D)為非常顯著因子;為

34、非常顯著因子;反應時間(反應時間(C)為非顯著因子。)為非顯著因子。51第五節(jié)第五節(jié) 酶類藥物的檢測酶類藥物的檢測 n肽鍵水解酶肽鍵水解酶 n脂鍵水解酶脂鍵水解酶 n糖苷鍵水解酶糖苷鍵水解酶 n其它(超氧化物歧化酶)其它(超氧化物歧化酶)52一、肽鍵水解酶一、肽鍵水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、彈性蛋白酶、彈性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶53541、胰蛋白酶、胰蛋白酶(Trypsin)n胰蛋白酶(胰蛋白酶(Trypsin) :由:由動物胰臟中提取的一種蛋動物胰臟中提取的一種蛋白水解酶白水解酶。n牛胰蛋白酶:牛胰蛋白酶:223個氨基酸,分子量個氨基酸,分子量24000,等電點等電點10.1。n

35、豬胰蛋白酶:豬胰蛋白酶:214個氨基酸,分子量個氨基酸,分子量23400,等電點等電點10.8。n胰蛋白酶最適胰蛋白酶最適pH為為7.68.0,電泳純的胰蛋白酶的比,電泳純的胰蛋白酶的比活為活為8000單位單位/mg。55胰蛋白酶胰蛋白酶56胰蛋白酶胰蛋白酶57原理原理n胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸堿性氨基酸的羧的羧基組成的基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵肽鍵、酰胺鍵及酯鍵,水解速度為,水解速度為酯鍵酯鍵酰胺酰胺鍵鍵肽鍵。肽鍵。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-A

36、nide)n苯甲酰苯甲酰L精氨酸乙酯(精氨酸乙酯(BAEE)在胰蛋白酶的作用下,)在胰蛋白酶的作用下,酯鍵被水解生成苯甲酰酯鍵被水解生成苯甲酰L精氨酸,在精氨酸,在253nm波長處波長處的吸收度隨酶促反應遞增,因此連續(xù)記錄不同時間的產的吸收度隨酶促反應遞增,因此連續(xù)記錄不同時間的產物生產量,根據活力單位定義計算酶活力。物生產量,根據活力單位定義計算酶活力。58測定法:測定法:n取呈取呈直線的吸收度直線的吸收度,按下式計算:,按下式計算:nP為為每每mg供試品含胰蛋白酶的單位供試品含胰蛋白酶的單位,U;A1為直線上終止的吸收度;為直線上終止的吸收度;nA2為直線上開始的吸收度;為直線上開始的吸收

37、度;nT為為A1至至A2讀數的時間,讀數的時間,min;nW為測定液中供試品的量,為測定液中供試品的量,mg;n吸收度每分鐘改變吸收度每分鐘改變0.003,即相當于,即相當于1個胰蛋白酶單位個胰蛋白酶單位 。下文為中國藥典下文為中國藥典2012015 5版胰蛋白酶活力測定方法,請仔細閱讀,版胰蛋白酶活力測定方法,請仔細閱讀,并闡述此酶活力測定的原理?其酶活力測定方法屬于哪一種?并闡述此酶活力測定的原理?其酶活力測定方法屬于哪一種?胰蛋白酶作用位點有哪些?寫出測定所用底物的英文縮寫?胰蛋白酶作用位點有哪些?寫出測定所用底物的英文縮寫? 供試品的制備:精密稱取本品適量,用鹽酸(供試品的制備:精密稱

38、取本品適量,用鹽酸(0.001mol/L0.001mol/L)制成每)制成每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶單位的溶液。胰蛋白酶單位的溶液。底物溶液的制備:取底物溶液的制備:取N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg85.7mg,加水溶解使成,加水溶解使成100ml100ml,作為底物原液;底物溶液應在制成后,作為底物原液;底物溶液應在制成后2 2小時內使用。小時內使用。測定法:取底物溶液測定法:取底物溶液3.0ml3.0ml,加鹽酸溶液(,加鹽酸溶液(0.001ml/L0.001ml/L)0.2ml0.2ml,混勻,作為,混勻,作為空白,取供試品

39、溶液空白,取供試品溶液0.2ml0.2ml加底物溶液(預熱至加底物溶液(預熱至25250.50.5)3.0ml3.0ml,立即計,立即計時并搖勻,使比色池內溫度保持在時并搖勻,使比色池內溫度保持在25250.50.5,照紫外可見分光光度法在,照紫外可見分光光度法在253nm253nm的波長處,每隔的波長處,每隔3030秒種讀取吸收度,共秒種讀取吸收度,共5 5分鐘。每分鐘。每3030秒鐘吸收度的變秒鐘吸收度的變化率應恒定在化率應恒定在0.0150.0150.0180.018之間,呈線性關系的時間不得少于之間,呈線性關系的時間不得少于3 3分鐘。若不分鐘。若不符合上述要求,應調整供試品的溶液濃度

40、,另行測定。以吸收度為縱坐標,符合上述要求,應調整供試品的溶液濃度,另行測定。以吸收度為縱坐標,時間為橫坐標做圖,取在時間為橫坐標做圖,取在3 3分鐘內成直線部分的吸收度,按下式計算。分鐘內成直線部分的吸收度,按下式計算。式中式中 P P為每為每1mg1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數;供試樣品中胰蛋白酶的單位數;A A1 1為直線上終止的吸收度;為直線上終止的吸收度;A A2 2為直線上開始的吸收度;為直線上開始的吸收度;T T為為A A1 1至至A A2 2讀數的時間(分);讀數的時間(分);W W為測定液中供試品的量;為測定液中供試品的量;0.0030.003為上述條件下,吸收度每分鐘改變

41、為上述條件下,吸收度每分鐘改變0.0030.003相當于一個胰蛋白酶單位。相當于一個胰蛋白酶單位。60 2、胰胰彈性蛋白酶彈性蛋白酶(Elastase) n肽鍵水解酶肽鍵水解酶,存在于哺乳動物胰臟。,存在于哺乳動物胰臟。n胰彈性蛋白酶是由胰彈性蛋白酶是由240個氨基酸組成的單一肽鏈,個氨基酸組成的單一肽鏈,有四對二硫鍵。分子量為有四對二硫鍵。分子量為25900,等電點為,等電點為9.5。n胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外,還可以水解胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外,還可以水解血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。n剛果紅彈性蛋白剛果紅彈性蛋白。61胰胰彈性蛋白酶測定彈性蛋白酶測定原理原理n剛

42、果紅彈性蛋白法剛果紅彈性蛋白法:以剛果紅:以剛果紅彈性蛋白為底物,彈性蛋白為底物,由于剛果紅由于剛果紅彈性蛋白結合的共價鍵能被彈性酶水解,彈性蛋白結合的共價鍵能被彈性酶水解,根據根據剛果紅在剛果紅在495nm處有最大吸收,由標準曲線即可查處有最大吸收,由標準曲線即可查得彈性酶單位數。得彈性酶單位數。n單位:單位:20分鐘水解分鐘水解1mg剛果紅彈性蛋白剛果紅彈性蛋白所需的酶量為所需的酶量為一個彈性酶活力單位一個彈性酶活力單位。62方法方法:n 633、尿激酶、尿激酶(Urokinase) n由人尿制得的一種堿性蛋白水解酶。由人尿制得的一種堿性蛋白水解酶。n主要作用是激活人體內主要作用是激活人體

43、內纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原使其成為使其成為有活性的有活性的纖維蛋白溶酶纖維蛋白溶酶,從而解聚血纖維蛋白,從而解聚血纖維蛋白,溶解血栓。溶解血栓。n天然尿激酶的分子量為天然尿激酶的分子量為54000,其作用于纖維蛋其作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶蛋白溶解酶。64效價測定原理效價測定原理(氣泡上升法氣泡上升法)n尿激酶尿激酶激活人體內激活人體內纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原使其轉化成使其轉化成纖維蛋白溶酶纖維蛋白溶酶;n纖維蛋白原纖維蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下,轉變成的作用下,轉變成纖維蛋白凝塊纖維蛋白凝塊,此凝塊在

44、,此凝塊在纖維蛋纖維蛋白溶酶白溶酶作用下,水解為可溶性小分子多肽。作用下,水解為可溶性小分子多肽。n在在纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原過量的情況下,過量的情況下,尿激酶量尿激酶量與與纖維蛋白凝塊的溶解時間纖維蛋白凝塊的溶解時間的對數成直線關系。的對數成直線關系。65操作操作(氣泡上升法氣泡上升法)n試管中加試管中加纖維蛋白原纖維蛋白原溶液溶液0.3ml(37水浴)水?。﹏標準品標準品(或供試品或供試品) 1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln立即搖勻計時,立即搖勻計時,反應系統(tǒng)應在反應系統(tǒng)應在3045秒內凝結秒內凝結,當當凝塊內小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時凝塊內小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時作為

45、反應作為反應終點。終點。n以尿激酶的濃度為橫坐標,以反應時間的對數為以尿激酶的濃度為橫坐標,以反應時間的對數為縱坐標。縱坐標。66二、脂鍵水解酶二、脂鍵水解酶 胰脂肪酶胰脂肪酶(Pancreatic Lipase )n胰脂肪酶是一種水解酶,在一定條件下把胰脂肪酶是一種水解酶,在一定條件下把甘甘油三脂類脂肪油三脂類脂肪水解,最后生成水解,最后生成甘油及脂肪酸甘油及脂肪酸。n底物底物:橄欖油橄欖油n用已知濃度的用已知濃度的標準堿溶液標準堿溶液滴定,可定量地測滴定,可定量地測定定脂肪酸脂肪酸的量,從而得知的量,從而得知脂肪酶脂肪酶活力。活力。67測定測定n 68計算計算n每分鐘每分鐘水解橄欖油水解橄

46、欖油產生產生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量,的酶量,為為1個活力單位。個活力單位。n每克含有的胰脂肪酶單位每克含有的胰脂肪酶單位nA:供試品消耗供試品消耗NaOH (0.1mol/L)的體積)的體積nB:空白消耗空白消耗NaOH (0.1mol/L)的體積)的體積nW:供試品取樣量(供試品取樣量(g)nN:供試品稀釋倍數。供試品稀釋倍數。69三、糖苷鍵水解酶三、糖苷鍵水解酶 溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的堿性水解酶分解粘多糖的堿性水解酶。n溶菌酶溶菌酶(Lysozyme)具有抗菌、抗病毒等作具有抗菌、抗病毒等作用。用。n溶菌酶分子量為溶菌酶分子量為1400015000,由,

47、由129個氨基個氨基酸殘基組成,等電點為酸殘基組成,等電點為10.011.1。n溶菌酶屬糖苷溶菌酶屬糖苷鍵鍵水解酶,能以某些細菌細胞中水解酶,能以某些細菌細胞中的多糖為底物。的多糖為底物。70溶菌酶作用位點溶菌酶作用位點71青霉素青霉素轉肽酶底物轉肽酶底物末端的二肽末端的二肽D-Ala-D-Ala結構結構72效價測定比濁法效價測定比濁法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌為底物,主要成分為為底物,主要成分為粘多糖粘多糖,粘多,粘多糖由糖由NAG和和NAM重復而成。重復而成。n只能水解只能水解NAM C1 和和NAG C4之間的之間的1,4糖糖苷鍵苷鍵。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經過溶菌酶的水解后,溶酶小

48、球菌胞壁中的粘多糖經過溶菌酶的水解后,導致導致溶菌溶菌,溶液的,溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的條件下,每分鐘在一定的條件下,每分鐘吸收度下降吸收度下降0.001為一為一個酶活力單位。個酶活力單位。73比濁法測定比濁法測定n計算:計算:n酶活力單位(酶活力單位(u/mg) =nW為測試液中供試品為測試液中供試品的重量(的重量(g)74比色法比色法- -測定溶菌酶活性測定溶菌酶活性 n用染料艷紅用染料艷紅K2BP標記的標記的M.Lysodeikticus為底物,酶催化細胞壁分解時游離出染色碎片為底物,酶催化細胞壁分解時游離出染色碎片(產物)(產物)n反應后離心除去未分解底物,上清液比色,反

49、應后離心除去未分解底物,上清液比色,吸吸收度為溶菌酶活力的函數收度為溶菌酶活力的函數。75溶菌酶效價測定比色法溶菌酶效價測定比色法n 76四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase) n由由動物紅細胞動物紅細胞制得的金屬酶,能催化超氧陰制得的金屬酶,能催化超氧陰離子轉化成過氧化氫和氧。離子轉化成過氧化氫和氧。n來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶(SOD)含銅和鋅,分子量)含銅和鋅,分子量32000左右。左右。nSOD對熱較穩(wěn)定對熱較穩(wěn)定,在,在pH5.39.5范圍內對范圍內對酶活性影響不大。酶活性影響不大。n牛紅細胞

50、牛紅細胞SOD PI為為4.95。77效價測定效價測定nSOD測定方法:測定方法:n間接法:使用間接法:使用氧自由基指示清除劑氧自由基指示清除劑, SOD與指示清與指示清除劑競爭除劑競爭O2- ,從而抑制指示清除劑與,從而抑制指示清除劑與O2- 的結合,的結合,根據根據指示清除劑與指示清除劑與O2- 反應速度的變化反應速度的變化可間接測定可間接測定SOD的活性。的活性。n間接法包括:間接法包括:黃嘌呤氧化酶細胞色素黃嘌呤氧化酶細胞色素C法法和和鄰苯三鄰苯三酚法酚法。78黃嘌呤氧化酶細胞色素黃嘌呤氧化酶細胞色素C法法n原理:原理:在有氧條件下,黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成在有氧條件下,黃嘌呤氧化酶

51、能催化黃嘌呤成尿酸,與此同時產生尿酸,與此同時產生O2- ,氧化型細胞色素,氧化型細胞色素C被被O2- 還還原為還原型細胞色素原為還原型細胞色素C,后者在,后者在550nm有最大吸收,因有最大吸收,因此測定氧化性細胞色素此測定氧化性細胞色素C在加入在加入SOD前后的光吸收變前后的光吸收變化可間接計算酶活性?;砷g接計算酶活性。79方法方法n 80注意點注意點n在特定條件下,在特定條件下,25 (pH7.8)每分鐘抑制細)每分鐘抑制細胞色素胞色素C還原速率達還原速率達50所需要的酶量為一個活所需要的酶量為一個活力單位。力單位。n注意事項:注意事項:n重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活,因此反應體重金

52、屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活,因此反應體系中必須添加系中必須添加EDTA。n反應體系中含過氧化氫酶可引起還原型細胞色素反應體系中含過氧化氫酶可引起還原型細胞色素C發(fā)生過氧化作用,從而干擾檢測的正確。發(fā)生過氧化作用,從而干擾檢測的正確。81鄰苯三酚法鄰苯三酚法n原理:原理:在堿性條件下,鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生在堿性條件下,鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅成紅 酚,同時生成酚,同時生成O2- ,當有,當有SOD 存在時由于存在時由于它能催化它能催化O2- 與與H+結合生成結合生成O2和和H2O2,從而阻止,從而阻止了中間產物的積累。了中間產物的積累。n定義定義:在一定條件下,在一定條件下,每分鐘抑制鄰苯三

53、酚自氧化每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達速率達50的酶量的酶量為一個酶活力單位。為一個酶活力單位。82操作操作n定義定義:在一定條件下,在一定條件下,每分鐘抑制鄰苯三酚自每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達氧化速率達50的酶量的酶量為一個酶活力單位。為一個酶活力單位。83門冬酰胺酶(門冬酰胺酶(L-Asparaginase)n本品系自大腸桿菌(本品系自大腸桿菌(Ecoli ASI.357Ecoli ASI.357)中提取制備)中提取制備的具有的具有酰氨基水解作用的酶。酰氨基水解作用的酶。n每毫克蛋白含門冬酰胺酶效價不得低于每毫克蛋白含門冬酰胺酶效價不得低于250U250U??鼓[抗腫瘤酶類藥物瘤酶類藥物

54、( (腫瘤細胞缺乏腫瘤細胞缺乏L-門冬酰胺合成酶門冬酰胺合成酶)。n治療小兒急性淋巴細胞性白血病和淋巴肉瘤。治療小兒急性淋巴細胞性白血病和淋巴肉瘤。84測定n在上述規(guī)定條件下,每分鐘在上述規(guī)定條件下,每分鐘催化催化L-門冬酰胺水解門冬酰胺水解釋放釋放1g分子氨所需的酶量分子氨所需的酶量定義定義為為1個酶活力單位個酶活力單位n比活力測定方法:采用比活力測定方法:采用Lowry法測定蛋白質含量,法測定蛋白質含量,比活力比活力=酶活力酶活力(U)/蛋白含蛋白含量量(mg)。85天冬氨酸酶活力的測定天冬氨酸酶活力的測定 ,一個酶活力單位定義為在測定一個酶活力單位定義為在測定條件下,條件下,每小時每克每

55、小時每克細胞轉化生細胞轉化生成成1mol天冬氨酸所需的酶量天冬氨酸所需的酶量. 86實例:尿激酶(實例:尿激酶(urokinase) n本品系從本品系從新鮮人尿中提取新鮮人尿中提取的一種的一種激活纖維蛋激活纖維蛋白溶酶原白溶酶原的酶。的酶。n由高分子量由高分子量54000和低分子量和低分子量33000組成的組成的混合物,混合物,高分子量含量不得少于高分子量含量不得少于90%,每,每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于蛋白中尿激酶活力不得少于12萬萬U,蛋,蛋白分解藥物。白分解藥物。87尿激酶尿激酶n(一)性狀(一)性狀n本品為白色非結晶狀粉末本品為白色非結晶狀粉末n(二)鑒別(二)鑒別n取比活力測定

56、項下的取比活力測定項下的供試品供試品溶液,用巴比妥溶液,用巴比妥-氯化鈉氯化鈉緩沖液(緩沖液(pH7.8)稀釋成每)稀釋成每1ml中含中含20U的溶液,的溶液,吸取吸取1ml,加,加纖維蛋白原纖維蛋白原溶液溶液0.3ml,再依次加入,再依次加入纖維蛋白溶酶原纖維蛋白溶酶原溶液溶液0.2ml,凝血酶凝血酶溶液溶液0.2ml,迅,迅速搖勻,立即置速搖勻,立即置370.5恒溫水浴中保溫,記時,恒溫水浴中保溫,記時,反應系統(tǒng)反應系統(tǒng)應在應在3045s內凝結,且凝塊在內凝結,且凝塊在15min內內重新溶解重新溶解。以。以0.9%氯化鈉溶液作空白,同法操作,氯化鈉溶液作空白,同法操作,凝塊在凝塊在2h內不

57、溶。內不溶。88(三)檢查(三)檢查 n1溶液的澄清度與顏色,溶液的澄清度與顏色, 應澄清無色。應澄清無色。n2分子組分比分子組分比 取本品,加水制成每取本品,加水制成每1ml中含中含2mg的溶液后,加入等體積的緩沖液,置水浴中的溶液后,加入等體積的緩沖液,置水浴中3min,放冷,作為供試品溶液;取供試品溶液放冷,作為供試品溶液;取供試品溶液10l,加至,加至樣品孔,照電泳法測定,按下式計算高分子尿激酶樣品孔,照電泳法測定,按下式計算高分子尿激酶相對含量(相對含量(%)。)。89(三)檢查(三)檢查n3干燥失重干燥失重 取本品,以五氧化二磷為干燥劑,在取本品,以五氧化二磷為干燥劑,在60減壓干燥至恒重,減失重量不得過減壓干燥至恒重,減失重量不得過5.0%。 n4異常毒性取本品,加氯化鈉注射液制成每異常毒性取本品,加氯化鈉注射液制成每1ml中含中含5000U的溶液,依法檢查,按靜脈注射法給藥,的溶液,依法檢查,按靜脈注射法給藥,應符合規(guī)定。應符合規(guī)定。n5熱原熱原 取本品,加氯

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論