1、 葛根素對大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的保護作用 浦踐一1，孫瑞軍2，趙琪2，門秀麗2#，張連元2 （1.華北煤炭醫學院附屬醫院，2.華北煤炭醫學院病理生理學教研室，河北 唐山 063000）摘要 目的：觀察葛根素預處理對大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的保護作用。方法：將健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組(n =10):對照組(Control)，肢體缺血再灌注組(LIR)和葛根素預處理組(Puerarin，Pue組)。各組大鼠均于肢體缺血4h 再灌注4h 處死,分別測定其動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，肺組織丙二醛(MDA)、Na+-K+-ATP酶活性、肺組織濕干比(W/D)

2、及肺組織髓過氧化物酶(MPO)含量，并觀察肺組織在光鏡下形態學的變化。結果:大鼠LIR后4h，PaO2明顯降低；W/D值、血漿及肺組織的MDA含量和肺組織MPO活性均明顯增加。Na+-K+-ATP酶活性降低，光鏡下顯示毛細血管擴張充血、血管周圍間隙增大、肺間質多形核粒細胞(PMN)聚集和浸潤。與LIR組比較，給予Pue預處理組大鼠各項損傷指標明顯減輕，Na+-K+-ATP酶活性升高。結論:葛根素預處理對大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷產生一定的保護作用,其機制可能與提高Na+-K+-ATP酶活性、減輕脂質過氧化反應有關。關鍵詞：葛根素；缺血再灌注；肺損傷；肢體Protective effects o

3、f puerarin on lung injury following limbs ischemia reperfusion of rats Pu jianyi1, Sun ruijun2, Zhao qi2, Men xiuli2#, Zhang lianyuan2 1. The affiliated hospital, North China Coal Medical University, 063000, Tangshan 2. Department of Pathophysiology, North China Coal Medical University, 063000, Tang

4、shan Abstract Objective : To investigate the protective effect s of puerarin on lung injury following limbs ischemia reperfusion of rats. Methods : Wistar rats were randomly divided into three groups (n =10): control group (Control), limbs ischemia reperfusion (LIR) group, and puerarin (Pue)group. A

5、t the end of the experiment, the partial pressure of oxygen (PaO2) and the partial pressure of carbon dioxide(PaCO2) in the artery blood and the contents of MDA, Na+-K+-ATPase, the ratio of W/D and MPO of lungs were measured. Results: After the ratshind limbs suffered ischemia reperfusion, the level

6、 of PaO2 and the activity of Na+-K+-ATPase decreased and the values of W/D, MDA and MPO of the lung tissue increased significantly in the LIR group; Under optical microscopy, there were congestion and swelling in pulmonary microvessels with broadened the spaces around the blood vessels. Leucocyte as

7、sembling and infiltration took place, which was dominated by polymorphocytes after LIR. Compared with LIR group, puerarin could attenuate lung tissue injury and increased the activity of Na+ -K+ -ATPase of lung tissues. Conclusion: Puerarin can protect the lung of rats from injury induced by limbs i

8、schemia reperfusion.Key words: puerarin, ischemia reperfusion, lung injury, limb. 多種原因，如腹主動脈瘤手術、四肢大血管栓塞或損傷、嚴重肢體擠壓傷、斷肢再植及肢體手術長時間應用止血帶等均可造成肢體缺血。部分肢體恢復充足的血供后不僅缺血骨骼肌出現損傷，而且還可出現機體多個臟器的功能和結構的損害。肺臟作為最易受損的器官之一，若損傷嚴重，則可導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，但目前對其發生機制尚未完全闡明。目前認為缺血再灌注導致的組織細胞損傷與缺血再灌注產生大量氧自由基、細胞Na+ -K+ -ATP酶活性降低及細胞內

9、鈣超載等有關1,2。葛根素是一種天然多酚類化合物,結構類似雌二醇,具有某些雌激素樣作用,研究發現它是一種天然的抗氧化劑,具有明顯的抗氧化作用,可消除體內過多的自由基,保護細胞膜的結構3。另有研究表明葛根素對缺血再灌注所致心、腦損傷有保護作用2,4,5。但葛根素對肢體缺血再灌注后肺損傷的影響尚無定論。本實驗通過建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型，經葛根素預處理，觀察肺呼吸功能、肺組織中丙二醛(MDA)含量和髓過氧化物酶(MPO)的活性及Na+ -K+ -ATP酶活性的改變，從而探討葛根素對大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的影響。1 材料與方法1.1 動物與分組 健康雄性Wistar 大鼠30只,體重200

10、-250g,喂養10d，隨機分成三組(n =10): (1)Control組: 常規飼養；(2)LIR組:常規飼養；(3)Pue組:術前7d,每天口服灌胃50 mg/kg的葛根素。1.2 動物模型復制 術前12h禁食，LIR組和Pue組按我室已成功構建的方法6復制動物模型。在乙醚淺麻醉下，用止血帶于雙后肢根部結扎4h 后松帶恢復血流灌注，對照組不結扎肢體其余操作同LIR組動物。1.3 標本采集及檢測 全部動物分別于實驗第8h (松解肢體結扎后4h)末，經腹主動脈放血處死動物,取動脈血后立即用自動血氣分析儀測定動脈血氧分壓(PaO2) 和二氧化碳分壓(PaCO2)。迅速取出肺臟,右肺300mg制

11、成10%組織勻漿,分別測定Na+ -K+ -ATP酶活性、MDA含量和MPO活性(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。另取取肺組織約300mg，用濾紙吸凈表面血跡后稱濕重,置于80烤箱烘干72h后取出稱干重,計算W/D比值。取左肺做組織學檢查。1.4 統計學分析 結果以均數±標準差(x±s)表示,采用SPSS11.5 軟件處理實驗數據,組間比較用One-WayANOVA,q檢驗。2 結果2.1 各組動物血氣分析結果及W/D 的變化 LIR組與Control組比較，W/D值明顯升高，PaO2明顯降低；Pue組W/D值雖然高于Control組，但較LIR組明顯降低，并且Pue

12、組大鼠PaO2明顯高于LIR組，差異均具有顯著性(表1) 表1 各組動物血氣分析結果及W/D的變化（x±s,n=10） Tab1 Results of blood gas analysis and the changes of W/D of lungs in different groups (x±s,n=10 ) Group PaO2 (mmHg) PaCO2 (mmHg) W/D Control 98.4 ±8.21 38.14 ±5.93 4.05 ±0.64 LIR 62.7 ±4.75* 35.23 ±7.27 5

13、.52 ±0.34* Pue 81.5 ±5.62# 36.67 ±4.26 4.58 ±0.21# *P<0.05,*P<0.01 vs Control group;#P<0.05,#P <0.01 vs LIR group2.3 各組動物肺組織Na+-K+-ATP酶活性、MDA和MPO的變化 LIR組與Control組比較,大鼠肺組織MDA和MPO均有不同程度的升高，但Na+-K+ -ATP酶活性顯著降低；與LIR組比較，Pue組Na+-K+-ATP酶活性升高，MDA和MPO均有不同程度的降低。差異均具有顯著性(表2). 表2

14、 各組動物肺組織Na+-K+-ATP酶活性、MDA和MPO的變化（x±s,n=10） Tab2 Changes of the activity of Na+-K+-ATPase and the level of MDA, MPO of lungs in different groups (x±s,n=10 ) Group Na+-K+-ATPase MDA MPO (molPi/mg pro/h) (nmol/mg pro) (U/g) Control 6.04±1.81 1.15 ±0.23 1.75 ±0.41 LIR 4.73±

15、0.84* 1.96 ±0.31* 2.48 ±0.19* Pue 5.45±1.62# 1.38 ±0.26# 1.89 ±0.33# *P<0.05,*P<0.01 vs Control group;#P<0.05,#P <0.01 vs LIR group2.3 光鏡下肺組織的形態學變化 與對照組比較,LIR組動物肺組織水腫,毛細血管擴張充血,血管周圍間隙增大,有大量白細胞浸潤,血管床中亦有大量炎性細胞聚集、附壁。而Pue組肺組織病變減輕(圖1)。 Control LIR Pue圖 1. 各組肺組織形態改變的比較F

16、ig1. Comparison of the changes in the lungs of different groups. (HE×200)3.討論 各種原因造成的肢體缺血是一種常見的臨床征象，恢復充足的血液供應乃缺血組織成活之關鍵，但是部分缺血組織回復血流灌注后又可導致缺血組織的進一步損傷，此稱為肢體缺血再灌注(LIR)損傷。如果缺血組織的范圍較廣泛，如腹主動脈瘤手術、主要的血管栓塞或損傷、高位肢體離斷、嚴重肢體擠壓傷及長時間應用止血帶等，再灌注損傷不僅存在于缺血組織，尚可進一步引發遠隔器官的損傷7。以前的研究表明，肢體缺血再灌注可繼發急性肺損傷，這種損傷的機制與氧化應激密切

17、相關8。 葛根為豆科植物Pueraria labta(Wild) Ohwi的干燥根,味甘,性辛涼,葛根素(C21 H20 O9 ) 為葛根的干燥根中分離、提取得到的8-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羥基異黃酮9。有研究表明葛根素對缺血再灌注所致心、腦損傷有保護作用2,4,5。 本實驗發現，LIR后PaO2明顯下降，PaCO2也有所下降，表明肺換氣功能障礙，W/D 升高提示肺含水量增加，這與光學顯微鏡下肺組織水腫、血管周圍間隙增大、肺毛細血管通透性增高的結果相符合；肺泡上皮型細胞的Na+-K+-ATP酶在肺泡液體主動轉運功能中占主導地位。而LIR組肺組織含水率的增加和Na+-K+-ATP酶活性降低說

18、明這種肺水腫的形成與Na+-K+-ATP酶活性降低有關。肺組織MDA水平升高說明氧自由基介導了肺組織細胞的損傷。肺組織MPO含量明顯升高表明肺組織有PMN浸潤，而PMN是活性氧的重要來源。預防性應用抗氧化劑可抑制脂質過氧化過程10。本研究中的應用葛根素預處理可在一定程度上抑制肺組織MDA水平升高,降低MPO活性，維持Na+-K+-ATP酶活性在較高水平,減輕肺損傷，改善呼吸功能障礙。 急性肺損傷發病機制錯綜復雜，多種效應細胞和介質參與了其發生發展過程,具體機制有待于進一步探討。本研究提示，葛根素能夠顯著改善大鼠肢體缺血再灌注后的急性肺損傷可能與其降低氧自由基水平、減輕脂質過氧化反應，提高Na+

19、-K+-ATP酶活性有關。參考文獻1.沈炳權，蔡兆斌，徐群紅等。葛根素對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用J. 中國中西醫結合急救雜志,2004,11(6):361-3632.唐瑜 葛根素對腦缺血再灌注損傷保護機制的研究現狀J. 四川生理科學雜志,2006, 28(4):177-1793. Boue SM, Wiese TE, Nehls S, et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. J Agric Food Chem, 2003, 51 (8): 2193-21994.張遠榮，蔣企洲。葛根素的抗氧化活性