1、熒光分光光度計(jì)使用工作原理熒光產(chǎn)生的原理熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見(jiàn)光照 射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。熒光產(chǎn)生的原理：化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并 儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng) 其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電 磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光化合物的兩種特征光譜1. 熒光激發(fā)光譜，就是通過(guò)測(cè)量熒光體的發(fā) 光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜，它反映了不同 波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率。2. 熒光發(fā)射光譜，如使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度 保持不變，而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過(guò)發(fā) 射單色器后照射于檢測(cè)器上，掃描發(fā)射單色器并 檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，然后通過(guò)記錄 儀記錄熒

2、光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，所得到 的譜圖稱為熒光光譜。物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作 該物質(zhì)的定性分析。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍 內(nèi)，其發(fā)射光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比 關(guān)系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法 或比色法為高，濃度太大的溶液會(huì)有自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會(huì)吸收激發(fā)光， 使發(fā)射光強(qiáng)度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強(qiáng)度與濃度不成 正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行。熒光發(fā)射的特點(diǎn)：可產(chǎn)生熒光的 分子或原子 在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能， 發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。溶液熒光光譜通常具有

3、的特征：(1) 斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀 察到的熒光的波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光的波長(zhǎng)。(2) 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。(3) 熒光發(fā)射光譜的形成與吸收光譜的形狀 有鏡像關(guān)系熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激 發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是 由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收 的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天 然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需 用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光 （特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接 觸。熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能 都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。 熒光效率是指熒光分子將

4、吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒 光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng) 度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激 發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè) 熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光 光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最 大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的 最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射 光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。測(cè)量原理稀溶液 |F=2.303 © FI0 & c b,其中，10為激發(fā)光強(qiáng)度;If為熒光強(qiáng)度；©f為熒光效率；b為液池厚度；£和

5、c分別為發(fā)光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和摩爾 濃度。技術(shù)指標(biāo)：波長(zhǎng)掃描范圍：220-900nm波長(zhǎng)精度：±1.5 nm;狹縫范圍：0.15-20 nm信噪比：S/N比150以上（水拉曼峰測(cè)定，狹 縫 5nm）最高掃描速度：5，500nm/min操作規(guī)程1. 開(kāi)機(jī)a. 確認(rèn)所測(cè)試樣液體或固體，選擇相應(yīng)的附 件。b. 先開(kāi)啟儀器主機(jī)電源，預(yù)熱半小時(shí)后啟動(dòng) 電腦程序RF-530XPC，儀器自檢通過(guò)后，即可 正常使用。2. 測(cè)樣(1) spectrum 模式a. 在 “ Acquire Mode 中選擇 “ Spectrum 模 式。對(duì)于做熒光光譜的樣品，"Configure中"

6、Parameters的參數(shù)設(shè)置如下："Spectrum Type 中選擇 Emission; 給定EX波長(zhǎng);給定EM的掃描范圍（最大范圍220nm 900nm）;設(shè)定掃描速度;掃描間隔;狹縫 寬度，點(diǎn)擊“OK完成參數(shù)的設(shè)定。對(duì)于做激發(fā)光譜的樣品，“ Con figure中"Parameters的參數(shù)設(shè)置如下："Spectrum Type 中選擇 Excitation;給定EM波長(zhǎng);給定EX的掃描范圍（最大范圍220nm 900nm）;設(shè)定掃描速度;掃描間隔;狹縫 寬度，點(diǎn)擊“OK,完成參數(shù)的設(shè)定。b. 在樣品池中放入待測(cè)的溶液，點(diǎn)擊"Start，”即可開(kāi)

7、始掃描。c. 掃描結(jié)束后，系統(tǒng)提示保存文件。可在Both"Presentation 中選擇 "Graf ”" Radar ”Axes Ctrl+R '來(lái)調(diào)整顯示結(jié)果范圍；在"Manipulate '中選擇"Peak Pick來(lái)標(biāo)出峰 位，最后在“Channel"中進(jìn)行通道設(shè)定。d. 述操作步驟對(duì)固體樣品同樣適用。(2) Quantitative 模式a. 在 “ Acquire Mode 中選擇“ Quantitative 模式。b. “ Con figure 中"“Parameters 的參數(shù)設(shè)置 如下：M

8、ethod 選擇 “ Multi Point WorkingCurve ” ;“Order of Curve 中選擇 “1s和“ No”給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度，點(diǎn)擊 “OK',完成參數(shù)的設(shè)定。c. 在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后 執(zhí)行“Auto Zero ”命令校零點(diǎn)。d. 點(diǎn)擊“Standard模式，制作工作曲線。e. 將樣品池中的空白溶液換成一系列的已知濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量，執(zhí)行“ Read'命令，得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，系統(tǒng)根據(jù)測(cè)量值自動(dòng) 生成一條 熒光強(qiáng)度-濃度”曲線。f. 在 “ Presentation 中選擇 “ Display Equation

9、 ”，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。將此工作曲線“Save為擴(kuò)展名為“ .std的文件。g. 工作曲線制備完畢，即可進(jìn)入未知樣的測(cè) 量，選擇進(jìn)入“Unknown模式，將樣品池中的 已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液換成待測(cè)樣品溶液，執(zhí)行“ Read命令，即可得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度和相應(yīng) 的濃度。將此“Save"為擴(kuò)展名為“.qnt的文件。(3) Time Course 模式a. 在 “ Acquire Mode 中選擇 “ Time Course "模式。b. “Configure中"“Parameters 的參數(shù)設(shè)置 如下：給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度；設(shè)定反應(yīng)時(shí) 間;讀取速度;讀取點(diǎn)數(shù)；點(diǎn)擊“

10、0K,完成參數(shù)的設(shè)定。c. 在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后 執(zhí)行“Auto Zero ”命令校零點(diǎn)。d. 將樣品池中的空白溶液換成待測(cè)溶液，點(diǎn) 擊“ Start,”即可開(kāi)始掃描。掃描結(jié)束后，即可 得到熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的工作曲線。e. 將此工作曲線“ Save為擴(kuò)展名為“ .TMC”的文件3. 關(guān)機(jī)退出軟件后關(guān)畢主機(jī)。注意事項(xiàng)a. 請(qǐng)注意愛(ài)護(hù)液體比色皿，特別是測(cè)試有機(jī) 樣品的同學(xué)請(qǐng)?jiān)跍y(cè)量完畢后用有機(jī)溶劑清洗， 干 燥后再放入盒子中，否則會(huì)造成比色皿表面嚴(yán)重 污染，影響透光度。b. 固體樣品池僅剩一個(gè)，測(cè)試完畢請(qǐng)物歸原 處。測(cè)試完畢請(qǐng)注意登記，關(guān)閉儀器。分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷無(wú)輻射躍遷一

11、一去活化過(guò)程處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過(guò)輻射或非輻射 躍遷等去活化過(guò)程返回至基態(tài) 。這些過(guò)程包括：1）振動(dòng)弛豫在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài) 的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周?chē)?分子，從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過(guò) 程，稱為振動(dòng)弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能 級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層 相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng) 耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，如 S2-S1;T2-T1。定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與 發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒光發(fā)射波長(zhǎng)處 的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到 激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng) 校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿?過(guò)程就是分子的激發(fā)過(guò)程。激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用 于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。2）發(fā)射光