1、參考教案：酵母蔗糖酶的提取純化與鑒定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（bD呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1，2-糖苷鍵裂解，釋放出等量的果糖和葡萄糖。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高 ,約為蔗糖1.361.60倍 ,在工業上具有較高的經濟價值。可用以轉化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高濃度糖漿中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的軟心糖,還可為果葡糖漿的工業化生產提供新的方法。蔗糖酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側和內側，在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。

2、在細胞膜內側細胞質中的稱之為內蔗糖酶，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內酶多兩個氨基酸，Ser和Met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(或22萬，與酵母的來源有關)，內酶約為13.5萬。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學性質仍十分相似，因此，本實驗未區分內酶與外酶，而且由于內酶含量很少，極難提取，本實驗提取純化的主要是外酶。每摩爾蔗糖水解產生兩摩爾還原糖，蔗糖的裂解速率可以通過NeLson法測定還原糖的產生數量來測定。一個酶活力單位規定為在標準分析條件下每分鐘催化底物轉化的數量。比活力單位為每毫克蛋白含有

3、酶活力單位。（本實驗以酵母為原料）一、教學目的通過酵母菌擴大培養及蔗糖酶的提取純化與鑒定使學生學會生物大分子（酶）制備方案設計和開展實踐研究的方法，體驗從復雜細胞混合物體系中提取純化酶的基本原理、過程和方法。本實驗為學生提供一個較全面的科學研究實踐機會，整個實驗過程學生獨立完成，雖然操作難度較大，所需要的實間較長（64學時），但每一步單元操作的原理清晰，技術成熟，實驗結果明顯，能給學生較多的設計空間和動手機會，有利于培養學生的學習興趣和從事科學研究的能力。二、教學內容實驗設計：包括講課，答疑，文獻綜述 6學時實驗一 酵母細胞破碎與蔗糖酶提取條件的選擇 8學時實驗二 蔗糖酶的鹽析曲線的制作與沉淀

4、分離 8學時實驗三 蔗糖酶的有機溶劑沉淀曲線的制作與沉淀分離 8學時實驗四 蔗糖酶的DEAE-纖維素柱層析純化 8學時實驗五 蔗糖酶的Sephadex G-150柱層析純化 8學時實驗六 蔗糖酶溶液的冷凍干燥 2學時實驗七 蔗糖酶的純度分析：聚丙烯酰胺凝膠電泳 8學時實驗八 蔗糖酶的理化性質研究 8學時三、實驗設計與研究1 器材與方法1.1主要單元操作技術與設備 1.1.2單元操作技術 細胞組織破碎術、離心分離技術、雙水相萃取技術、離子交換層析技術、凝膠層析技術、超濾技術、冷凍干燥技術、分光光度技術、電泳技術等生物分離與檢測技術；1.1.2主要設備 烘箱、恒溫搖床、真空干燥箱、分析天平、電子臺

5、秤、超聲波細胞破碎儀、粉碎機、超濾器（500ml5000ml）、冷凍離心機（8000-10000 r/min，50ml×6；250ml×6）、普通離心機（5000 r/min，200ml×4）、臺式離心機（16000 r/min,5ml×6）冷凍干燥機、-80度冰箱、制冰機、酸度計、電熱恒溫水浴鍋、勻漿機、蛋白質色譜分離系統（核酸蛋白檢測儀、部分收集器、蠕動泵、梯度混合器、10-25mm,h300-700mm層析柱）電泳儀及垂直板電泳槽、脫色搖床、紫外-可見光分光光度計、熒光分光光度計、高效液相色譜、氣相色譜、凝膠成像系統、250ml和500ml旋轉蒸發

6、儀、微量凱氏定氮儀、常量凱氏定氮儀、500-1000W電爐、超聲波清洗器、振動混合器、移夜槍（200-5000ul）、層析缸、電吹風等。1. 2 實驗材料與試劑1.2.1酵母菌的擴大培養：采用采用實驗室經過篩選誘變獲得的酵母菌,增殖培養基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸鎂0.1g/L 和磷酸二氫鉀0.1g/L，調節pH 為5.0。發酵培養基：葡萄糖1215、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L，七水硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鉀0.1g/L 和硫酸銨0.5g/L，調節pH為5.0。1.2.2實驗試劑甲苯（使用前預冷到0以下）；95%乙醇；DEAE-纖維素

7、；Sephadex G-150；0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.3 ；十二烷基硫酸鈉(SDS);其余試劑均為國產分析純。1. 2 分析方法1.2.1蛋白質濃度的測定：采用Folin法（試劑方法參考生物化學原理和方法）。1.2.2還原糖的測定：采用DNS法（試劑方法參考生物化學原理和方法）。1.2.3酶活性測定（參考：徐樺,陸珊華,孫愛民.酵母蔗糖酶Km值的測定J .南京醫科大學學報,1999,17(4):329-330）取適當稀釋的酶液0.5mL,加入0.3 mLpH4.6、0.1mol/L的NaAc-HAc 緩沖液,0.2mL 0.1mol/L的蔗糖,37準確反應15mi

8、n,后加0.125mL1mol/L的NaOH中止反應。用DNS法在540nm波長下測定形成的還原糖量。在測定條件下以每分鐘內能水解蔗糖成還原糖,經DNS測定光吸收讀數為1 mA 所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。1.2.4 蔗糖酶的純度分析：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（試劑方法參考生物化學原理和方法）2 酵母蔗糖酶的提取純化工藝2.1粗酶制備（蔗糖酶的提取）目前關于酵母中蔗糖酶提取純化方面的研究較多，常用方法有甲苯研磨（自溶）法、凍融研磨法、SDS 抽提法等。其中甲苯自溶法耗時長，效率低，目前很少使用。2.1.1甲苯自溶法 稱取酵母泥50g,加入20mL雙蒸水使其溶解,加入5g NaAc和10

9、m甲苯,搖床振蕩 10min ,37恒溫水浴48h。再加入10mL 4 mol/L的HAc和15mL雙蒸水,調pH至4.5,于4、3000 r/min 離心30 min ,離心后將中層清液移出即為粗制酶液,4保存。2.1.2甲苯研磨法 取50酵母泥（準確稱量），加10g石英砂，加蒸餾水20ml，研磨5min,，加20mL甲苯，繼續研磨10分鐘左右，共3次，使其呈糊狀。將研磨好的內容物轉移到50mL離心管中，平衡后以10000rpm離心15分鐘。用吸管小心將離心后的中間水層轉移到干凈的離心管中，勿帶上層甲苯相，然后以10，000rpm離心15分鐘。將3步離心后的上清夜取出，倒入量筒中記錄其體積，

10、留下1.5mL作為第一組分粗抽提液以備酶活力測定和蛋白濃度測定。2.1.3凍融研磨法 稱取酵母泥50g ,加入20mL雙蒸水 ,置于預先冷卻的研缽中,研磨25min ,冰箱中冷凍約15min(以研磨內液面上剛出現凍結為宜),取出再研磨25min ,重復以上步驟兩次。后置于冰箱中冷凍3h取出,溫浴融化,用1 mol/L的HAc調pH至5.0,40水浴30min,冷卻后4、10000r/min 離心15min,取上清液即為粗制酶液,4保存。2.1.4 SDS抽提法 稱取酵母泥50g,加入50mL0.3mmol/L的SDS溶解, 40水浴10 h后取出 ,4、10000 r/ min離心15 min

11、 ,取上清液即為粗制酶液,4保存。2.1.5超聲波細胞破碎頻率超過1520kHz的超聲波，在較高的輸入功率下(100250W)可破碎細胞。其工作原理是：超聲波細胞破碎機由超聲波發生器和換能器兩個部分組成。超聲波發生器(電源)，是將220V、50Hz的單相電通過變頻器件變為2025Hz、約600V的交變電能，并以適當的阻抗與功率匹配來推動換能器工作，做縱向機械振動，振動波通過浸入在樣品中的鈦合金變幅桿對破碎的各類細胞產生空化效應，從而達到破碎細胞的目的。細胞破碎過程中，用于分析細胞破碎率的檢測技術對于細胞破碎效果的評估、破碎工藝的選擇、工藝放大和工藝條件優化等起著非常重要的作用。最常用的檢測細胞

12、破碎效果的方法是通過顯微鏡直接觀察，如用革蘭氏染色法，也可以通過測定核酸與蛋白質的含量判斷細胞破碎率。正交試驗法是研究與處理多因素試驗的種實驗設計方法，它可以利用規格化的正交表通過整體設計、綜合比較和統計分析，能在很多的試驗條件中選出代表性強的少數條件，并能通過較少次數的試驗找到較好的實驗條件，即最優或較優的方案。在生產實踐和科學研究中對于因素多、周期長、有誤差的類試驗問題，正交試驗法的效果尤其顯著。關于正交實驗法的書籍目前比版很多，這里不再敘述。本實驗應用正交試驗法選擇酵母細胞超聲破碎的最佳實驗條件。本實驗要求考察的有三個因素即細胞濃度、超聲能量和破碎時間，每個因素有四個位級（或稱水平）。現

13、綜合成一張因素位級表如下： 因素試驗號A、細胞濃度B、超聲能量(%)C、破碎時間(分鐘)13%20%32 6%40%639%60%9412%80%12如果每個因素各個位級的所有組合都做試驗，要做43=64次。為了使試驗次數減少而又能得到較好的結果，需要選用合適的正交表。現有正交表L16（45），能安排5個4位級的因素，只需做16次試驗。本實驗中有3個4位級的因素，所以可以選用此表來安排試驗。如果不考慮因素之間的交互作用，進行表頭設計時，則把因素A、B、C分別放入正交表L16（45）的第5、2和1列上。2.2沉淀分離2.2.1 鹽析沉淀 鹽析曲線的制作：a.取7支干凈試管編號17，分別加入粗酶液

14、5 ml； b.分別向15號試管中加入飽和硫酸銨1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分別加入蒸餾水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分別向6號、7號試管中加先入固體硫酸銨0.66g和1.37g，再加飽和硫酸銨5 ml，充分搖晃溶解完全后，每管各取5ml×2混勻的溶液裝入7ml×2離心管中，對應編號1、1/7、7/，靜置1h以上，對稱放入離心機中，10000 r/min ，離心10min，棄去上清液，收集沉淀。c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1mol/L（pH7.0）緩沖溶液溶解沉淀物；d.采用Folin法測定各管中蛋白質的濃度，采用D

15、NS測定還原糖。e.以硫酸銨飽和度為橫坐標，蛋白質濃度和酶活力的含量為縱坐標作圖，得到蛋白質鹽析曲線和酶活力鹽析曲線。鹽析制備蔗糖酶根據鹽析曲線選擇硫酸銨飽和度(3040%飽和度)去除雜質，選擇硫酸銨飽和度(約60%飽和度)沉淀酶蛋白。并計算每升溶液達到3040%飽和度和60%飽和度所需要的固體硫酸銨的量（g），根據酶蛋白粗提液的體積計算3040%飽和度和60%飽和度時實際所需要的固體硫酸銨的量（g）。在酶蛋白粗提液中加入經研細的(NH4)2SO4粉末 ,使其達到3040%飽和度,充分溶解后,4，10000r/min ,離心20 min ,除去沉淀。收集上清夜。繼續向上清液中加入(NH4)2S

16、O4粉末，使其達到 60 %飽和度 ,充分溶解后，4，10000 r/min ,離心 20 min ,棄去上清液，收集沉淀。-I將沉淀溶于少量緩沖溶液中 ,充分混均 ,4 透析約12 h后,進一步純化。（取5mL用于蛋白含量測定和純度分析）2.2.2乙醇沉淀乙醇沉淀曲線的制備：方法同鹽析曲線的制作乙醇沉淀：在細胞破碎的粗制酶液中加入乙醇使其質量分數達 30%, 4放置過夜,4，10000 r/ min 離心20min ,取上清液 ,再追加乙醇使其終質量分數達 50 %。4 放置 1 h ,4、10000r/ min 離心 20 min ,棄上清液 ,沉淀用蒸水溶解,4保存，必要時透析。（pH值

17、為7.0的0.05molL Tris-HCl緩沖液）。2.3層析分離2.3.1 DEAE-纖維素柱層析DEAE-纖維素( DE 52) 經常規處理后,裝柱( 100mm×10mm) , 用起始緩沖液0.05MTris-HCl pH7.3緩沖液平衡, 調節流速為每2min 1mL,按照3-5%的床體積加樣, 先用0.05MTris-HCl緩沖液洗脫,然后鹽度梯度洗脫,由0.05MTris-HClpH7.3 緩沖液到0.1MNaCl的0.05MTr is-HClpH7.3 緩沖液, 每管收集3mL, 約120min 流動相，在280nm處進行紫外檢測，獲得洗脫曲線，同時測定峰管的酶活力，

18、將最高酶活力的若干管酶液集中，分裝后低溫保存，用于性質測定。留2 mL酶液測酶活和蛋白含量。2.3.2 Sephadex G-150柱層析 選用15×600800mm Sephadex G-150層析柱，加樣量為 35mL （約含蛋白100mg）用 20mmol/L （pH為7.0 ）的緩沖液進行洗脫，洗脫速度可控制為 0.51.0mL/min，每管收集3ml，約2530管，各管可用 A280 的紫外線進行檢測，獲得洗脫曲線，同時測定峰管酶活力。將最高酶活力的若干管酶液集中，分裝后低溫保存，用于性質測定。留2 mL酶液測酶活和蛋白含量。2.4 冷凍干燥將經過DEAE-纖維素柱層析或Q Sepharose 柱層析或Sephadex G-150柱層析收集的酶溶液放入凍存管中，至于-80冰箱中預凍4h以上，再置于冷凍干燥機中冷凍干燥，直至成凍干粉。3.結果與討論3.1細胞產量：濕細胞、干細胞3.2酶活力、蛋白質濃度的測定 3.