1、1.掌握原子吸收光譜法的原理、了解原子吸收光掌握原子吸收光譜法的原理、了解原子吸收光譜儀的基本構(gòu)造，熟悉標(biāo)準曲線法及標(biāo)準加譜儀的基本構(gòu)造，熟悉標(biāo)準曲線法及標(biāo)準加入法、熟悉靈敏度和檢出限的計算方法。入法、熟悉靈敏度和檢出限的計算方法。 。 2.熟悉激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光壽命、熒光效熟悉激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光壽命、熒光效率等概念，掌握熒光光譜的特點、影響物質(zhì)率等概念，掌握熒光光譜的特點、影響物質(zhì)發(fā)光的因素及光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系，發(fā)光的因素及光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系，了解熒光光譜儀的基本構(gòu)造，熟悉標(biāo)準曲線了解熒光光譜儀的基本構(gòu)造，熟悉標(biāo)準曲線法及比例法。法及比例法。 3.了解色譜分離理論

2、、色譜儀的基本構(gòu)造、進行了解色譜分離理論、色譜儀的基本構(gòu)造、進行物質(zhì)定性分析和定量測定的基本原理。物質(zhì)定性分析和定量測定的基本原理。 一、概述一、概述 1. History: 2. Definition : AAS是基于光源輻射出待測元素的特是基于光源輻射出待測元素的特征譜線，通過樣品的原子蒸氣時，被蒸氣中待測征譜線，通過樣品的原子蒸氣時，被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子吸收，通過測量吸光度對元素進元素的基態(tài)原子吸收，通過測量吸光度對元素進行定量分析的方法。行定量分析的方法。 二、原理二、原理 1.原子吸收光譜的產(chǎn)生原子吸收光譜的產(chǎn)生 : = c/ = hc/h = hc/ E 2.原子吸收測量的基

3、本關(guān)系原子吸收測量的基本關(guān)系 A= -lgT = lg Iov / Iv =0.4343KNL三、原子吸收光譜儀三、原子吸收光譜儀 單色器檢測器光源吸收池顯示器原子化器檢測器光源單色器顯示器1.光源光源 -空心陰極燈空心陰極燈(hollow cathode lamp) 2. 原子化器原子化器(atomizer) (1) 火焰原子化器火焰原子化器 (2) 電熱原子化器電熱原子化器 3. 3. 單色器：平面光柵單色儀單色器：平面光柵單色儀 4. 4. 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) ：光電倍增管：光電倍增管四、測量分析方法四、測量分析方法 1、校準曲線法、校準曲線法(calibration curve)2、標(biāo)準

4、加入法標(biāo)準加入法(standardadditions) 五、樣品的處理五、樣品的處理 dryingashingatomizing cleaningTTime干燥干燥-灰化灰化-原子化原子化-凈化凈化六、靈敏度和檢出限六、靈敏度和檢出限 1. 靈敏度靈敏度 特征濃度特征濃度(characteristic concentration)：產(chǎn)生產(chǎn)生1%吸收（吸收（0.0044 A）所需濃度。所需濃度。 Sc = C 0.0044 / A 特征質(zhì)量特征質(zhì)量(characteristic mass)： mc = C V0.0044 / A 2. 檢出限檢出限 CASSSCbbL 22火火焰焰法法：VCmL

5、L 石墨爐法：石墨爐法： 一、概述一、概述 熒光熒光(fluorescence):當(dāng)物質(zhì)分子吸收光子能量當(dāng)物質(zhì)分子吸收光子能量而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動能而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回到基態(tài)能級時所發(fā)射出的光級返回到基態(tài)能級時所發(fā)射出的光 熒光分析法熒光分析法(fluorometry) :通過測定分子所發(fā)通過測定分子所發(fā)射熒光的特征和強度，對物質(zhì)進行定性、射熒光的特征和強度，對物質(zhì)進行定性、定量分析的方法定量分析的方法 分子熒光分析法分子熒光分析法（molecular fluorometry） :物物質(zhì)在可見質(zhì)在可見-紫外光區(qū)激發(fā)并發(fā)射的熒光紫外光區(qū)激發(fā)并發(fā)射的熒光 1、激發(fā)光

6、譜和發(fā)射光譜、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜(excitation spectrum)：固定某一固定某一發(fā)射波長，測定熒光發(fā)射強度發(fā)射波長，測定熒光發(fā)射強度(F)隨激發(fā)隨激發(fā)波長波長( ex)變化所得的光譜變化所得的光譜 熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜（emission spectrum）或或熒光光熒光光譜譜（fluorescence spectrum）：固定某一激固定某一激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射強度隨發(fā)射波長發(fā)波長，測定熒光發(fā)射強度隨發(fā)射波長變化所得的光譜變化所得的光譜350400F375347366386熒光波長熒光波長407nmF激發(fā)光波長激發(fā)光波長386nm40743045340

7、0460430激發(fā)光譜激發(fā)光譜熒光光譜熒光光譜2 2、熒光壽命和熒光效率、熒光壽命和熒光效率 熒光壽命熒光壽命(fluorescence life time， f)：當(dāng)除去激當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的大熒光強度的1/e所需的時間所需的時間 熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率(fluorescence quantum yield， )：吸收激發(fā)光的量子數(shù)吸收激發(fā)光的量子數(shù)發(fā)射熒光的量子數(shù)發(fā)射熒光的量子數(shù) fftoln tFF 3、影響物質(zhì)發(fā)光的因素、影響物質(zhì)發(fā)光的因素 （1）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 能夠發(fā)射熒光的能夠

8、發(fā)射熒光的物質(zhì)應(yīng)同時滿足兩個條件：物質(zhì)分子必須有物質(zhì)應(yīng)同時滿足兩個條件：物質(zhì)分子必須有強的紫外強的紫外-可見吸收，有一定的熒光效率。分可見吸收，有一定的熒光效率。分子中有共軛子中有共軛 鍵、剛性平面結(jié)構(gòu)、分子上的給鍵、剛性平面結(jié)構(gòu)、分子上的給電子取代基使熒光增大，而吸電子取代基則電子取代基使熒光增大，而吸電子取代基則降低熒光強度。降低熒光強度。 （2）影響熒光強度的外部因素：若溫度升高，）影響熒光強度的外部因素：若溫度升高，降低熒光效率和熒光強度；熒光波長隨著溶降低熒光效率和熒光強度；熒光波長隨著溶劑極性的增加而長移，熒光強度增加；溶液劑極性的增加而長移，熒光強度增加；溶液的的pH；熒光焠滅劑

9、。熒光焠滅劑。 二、光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系二、光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 It = Io 10- bc Ia=Io - It F = Io(1-10- bc) = Io(1- e-2.303 bc) 對于稀溶液，對于稀溶液， bc 0.02時：時： F = 2.303 Io bc =（2.303 Io b ）c F = K c 三、熒光光譜儀 四、定量分析方法及應(yīng)用四、定量分析方法及應(yīng)用 1、校準曲線法：用已知濃度的標(biāo)準物質(zhì)經(jīng)過和、校準曲線法：用已知濃度的標(biāo)準物質(zhì)經(jīng)過和未知樣品相同的處理之后，配制溶液，逐一未知樣品相同的處理之后，配制溶液，逐一測定熒光強度，以熒光強度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準測定熒光

10、強度，以熒光強度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準曲線。在校溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準曲線。在校準曲線中查出對應(yīng)濃度。準曲線中查出對應(yīng)濃度。 scFxFFsFcx oo2、比例法：、比例法：3、熒光分析法的應(yīng)用、熒光分析法的應(yīng)用 （1）無機化合物的分析：形成熒光螯合）無機化合物的分析：形成熒光螯合物的直接分析法；被測物作為熒光熄滅物的直接分析法；被測物作為熒光熄滅劑的熒光熄滅分析法劑的熒光熄滅分析法 （2）有機化合物的熒光分析）有機化合物的熒光分析 ：芳香族及：芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物；還原型輔酶具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物；還原型輔酶I（NADH）和還原型輔酶和還原型輔酶II（NADP

11、H）；）； （3）熒光標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用熒光標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用：常用溴化乙錠常用溴化乙錠 EB 一、色譜法發(fā)展簡史一、色譜法發(fā)展簡史 固定相固定相（stationary phase）：按按形狀分為形狀分為柱色柱色譜法，毛細管色譜法，平板色譜法；按譜法，毛細管色譜法，平板色譜法；按材料材料分為吸附色譜法，分配色譜法，離子交換色分為吸附色譜法，分配色譜法，離子交換色譜法，凝膠色譜法，生物親和色譜法譜法，凝膠色譜法，生物親和色譜法 色譜柱色譜柱 （packed column） 流動相流動相（mobile phase）：氣相色譜氣相色譜(gas chromatography，G

12、C)；液相色譜液相色譜(liquid chromatography，LC)；超臨界流體色譜法超臨界流體色譜法(supercritical fluid chromatography，SFC) 二、色譜儀 氣相色譜儀示意圖氣相色譜儀示意圖 高效液相色譜示意圖高效液相色譜示意圖 響應(yīng)值與時響應(yīng)值與時間的關(guān)系的間的關(guān)系的色譜圖色譜圖 三、色譜法分離理論三、色譜法分離理論 1、基本術(shù)語、基本術(shù)語 色譜圖色譜圖(chromatogram) 以組分的響應(yīng)值為縱坐以組分的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，組分的流出時間為橫坐標(biāo)所得標(biāo)，組分的流出時間為橫坐標(biāo)所得 基線基線（base line）當(dāng)色譜柱中僅有流動相通過時，當(dāng)色譜柱

13、中僅有流動相通過時，檢測器響應(yīng)信號隨時間變化的紀錄，應(yīng)是平行檢測器響應(yīng)信號隨時間變化的紀錄，應(yīng)是平行于橫軸的直線于橫軸的直線 色譜峰色譜峰（chromatographic peak） 組分通過測試組分通過測試器所得到的響應(yīng)信號的大小隨時間變化所形成器所得到的響應(yīng)信號的大小隨時間變化所形成的峰形曲線。不正常的有：拖尾峰的峰形曲線。不正常的有：拖尾峰(tailing peak)及前延峰及前延峰(leading peak)。 fs在在0.951.05之間為對稱峰；小于之間為對稱峰；小于0.95為前延峰；為前延峰；大于大于1.05為為拖尾拖尾峰峰 峰高峰高( (h h): ): 峰頂?shù)交€的垂直距離；

14、半峰寬峰頂?shù)交€的垂直距離；半峰寬( (W W1/21/2): ): 峰高一半處色譜峰的寬度；峰面積峰高一半處色譜峰的寬度；峰面積( (A A):): A A h hW W1/21/2 保留時間保留時間(retention time；tR) 試樣中各組分在色譜試樣中各組分在色譜柱中滯留的時間柱中滯留的時間 死時間死時間（void time；tM）：不被固定相吸附或溶不被固定相吸附或溶解物質(zhì)從進柱到出柱出現(xiàn)響應(yīng)值最大時解物質(zhì)從進柱到出柱出現(xiàn)響應(yīng)值最大時t t調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間（adjusted retention time；tR）：）： 扣除了死時間之后的保留時間扣除了死時間之后的保留時間

15、XYXXWfs2)(2h05. 0 2、塔板理論、塔板理論 （1）理論塔板高度（）理論塔板高度（Height equivalent to a theoretical plate；H）把色譜柱看作分餾塔，把色譜柱看作分餾塔，每個塔板之間的距離。每個塔板之間的距離。 （2）理論塔板數(shù)）理論塔板數(shù)(The number of theoretical plates) 在一定柱長（在一定柱長（L）中的塔板的數(shù)目（中的塔板的數(shù)目（N） 2212)(54. 5)(16WtWtHLNRR 3、速率理論、速率理論 色譜柱的柱效也就是峰寬受四個力學(xué)因素控制，色譜柱的柱效也就是峰寬受四個力學(xué)因素控制，即渦流擴散項、

16、分子擴散項、流動相和固定即渦流擴散項、分子擴散項、流動相和固定相傳質(zhì)阻力項。用板高方程表示為：相傳質(zhì)阻力項。用板高方程表示為： uCuBAHA、B、C分別表示渦流擴散系數(shù)、分子擴分別表示渦流擴散系數(shù)、分子擴散系數(shù)、流動相和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)之散系數(shù)、流動相和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)之和。只有當(dāng)和。只有當(dāng)A、B、C較小時，較小時，H才能小，才能小，柱效才能高。反之柱效低，色譜峰將展寬。柱效才能高。反之柱效低，色譜峰將展寬。四、色譜法中的定性和定量方法四、色譜法中的定性和定量方法 1 1、定性方法、定性方法 2 2、利用峰面積定量、利用峰面積定量 3 3、色譜法分析中生物樣品的預(yù)處理、色譜法分析中生物樣

17、品的預(yù)處理 21R21R2R1221WWtWWttR4 4、分離度、分離度( (resolution)resolution)課后練習(xí)課后練習(xí) p308 1、3、6、9、10一、原子吸收分光光度法一、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于試樣的基態(tài)原子蒸氣原子吸收分光光度法是基于試樣的基態(tài)原子蒸氣對特征輻射的吸收作用來進行元素定量分析的對特征輻射的吸收作用來進行元素定量分析的方法。方法。 原子吸收的測量原子吸收的測量 根據(jù)根據(jù)Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 原子吸收分光光度計原子吸收分光光度計 原子吸收分光光度計主要原子吸收分光光度計主要由光源、原子化器、分光系統(tǒng)

18、和檢測系統(tǒng)等四由光源、原子化器、分光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)等四部分組成部分組成 定量分析方法定量分析方法 原子吸收光譜法常用的定量方法原子吸收光譜法常用的定量方法有標(biāo)準曲線法和標(biāo)準加入法。有標(biāo)準曲線法和標(biāo)準加入法。 二、熒光分析法二、熒光分析法 激發(fā)光譜反映熒光強度隨激發(fā)光波長的變化情況，激發(fā)光譜反映熒光強度隨激發(fā)光波長的變化情況，熒光光譜反映熒光強度隨熒光波長的變化情況。熒光光譜反映熒光強度隨熒光波長的變化情況。固定熒光波長，以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光固定熒光波長，以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)，可繪制物質(zhì)的激發(fā)光譜；固定強度為縱坐標(biāo)，可繪制物質(zhì)的激發(fā)光譜；固定激發(fā)光波長和強度，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒激發(fā)光波長和強度，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)，可繪制物質(zhì)的熒光光譜。激光強度為縱坐標(biāo)，可繪制物質(zhì)的熒光光譜。激發(fā)光譜和熒光光譜可以用于對物質(zhì)進行定性分發(fā)光譜和熒光光譜可以用于對物質(zhì)進行定性分析，也可用于熒光測定時激發(fā)波長和測量波長析，也可用于熒光測定時激發(fā)波長和測量波長的選擇。的選擇。 物質(zhì)分子產(chǎn)生熒光必需滿足兩個條件：在紫物質(zhì)分子產(chǎn)生熒光必需滿足兩個條件：在紫外外- -可見光譜區(qū)有強吸