1、海馬神經元谷氨酸損傷研究         10-02-03 15:01:00     作者：周松林，陳益人，丁斐    編輯：studa20【摘要】  目的：本研究通過觀察體外培養的大鼠胚胎海馬神經元在谷氨酸損傷后，細胞活力變化及細胞損傷的方式，初步探討谷氨酸對神經元的損傷機制。方法：通過MTT，觀察不同濃度(62.5 M、125 M、250 M、500 M)的谷氨酸損傷后不同時間（6 h、12 h、18 h、24 h)海馬神

2、經元活力的變化。經相差顯微鏡觀察谷氨酸對海馬神經元胞體及突起的影響。通過TUNEL、Hoechst染色比較正常培養組和損傷組的凋亡率，分析谷氨酸對海馬神經元的損傷作用。結果：MTT結果顯示，谷氨酸對體外培養的胎鼠海馬神經元有興奮毒性，在所觀察的劑量范圍內，隨著谷氨酸濃度的增加，作用逐步增強，至500 M達峰值，隨著損傷后孵育時間的延長，海馬神經元活力逐漸下降。TUNEL和Hoechst染色結果也顯示，125 M谷氨酸對體外培養的胎鼠海馬神經元有興奮毒性，主要引起海馬神經元的凋亡。結論：谷氨酸對體外培養的胎鼠海馬神經元有興奮毒性,且這種作用呈現劑量相關性。中等劑量（125 M）谷氨酸損傷主要引起

3、海馬神經元的凋亡。 【關鍵詞】  谷氨酸 海馬神經元 TUNELAbstract   Objective: To investigate the changes of cell vitality in cultured hippocampal neurons after glutamate stimulation, and the cellular mechanisms involved in neurotoxicity. Methods: Different concentrations of glutamate (62.5 M, 125 M, 250 M, 5

4、00 M) were applied to the cultured rat embryonic hippocampal neurons. Methyl-thiazole-tetrazolium (MTT) assay was used to detect the neuronal vitality after incubation different periods (6 h, 12 h, 18 h, 24 h). After glutamate was applied to the cells, phase contrast microscope, TUNEL and Hoechst as

5、say were used to identify the glutamate-induced neurotoxicity. Results: The results of MTT indicated that glutamate could evoke neurotoxicity to the cultured hippocampal neurons, and when the concentrations of glutamate and the incubation time increased, the neurotoxicity augmented. Morphological ob

6、servation, TUNEL and Hoechst revealed that glutamate induced hippocampal cell death in a prevailing form of apoptosis. Conclusion: Glutamate have obviously neurotoxicity in cultured 78 days hippocompal neurons in a dose-effect character, with apoptosis predominating after exposure to medium concentr

7、ations of glutamate in a delayed time course.Key words   Glutamate; Hippocampal neurons; Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end-labeling腦卒中以高死亡率和高致殘率嚴重威脅著人類的健康和社會勞動能力。在腦缺血過程中，各種神經遞質發生一系列變化，如腦內氨基酸類神經遞質大量增加，特別是缺血中心區域。興奮性氨基酸如谷氨酸(glutamate, Glu)和天冬氨酸(aspartic, Asp )的過量釋放是

8、缺血性腦損傷的重要病理機制。據報道谷氨酸受體拮抗劑對腦缺血損傷有很好的保護作用1。同樣，抑制性氨基酸對腦缺血有保護作用，可拮抗興奮性氨基酸的毒性2。很多學者認為，興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的平衡失調是缺血性腦損傷的原因之一3。海馬是邊緣系統的重要組成部分，在學習、記憶、情緒反應及植物性神經功能等方面有重要作用，是老年性癡呆、癲癇等疾病的主要病灶之一，在結構上具有高度序化板層結構和神經元相對獨立分布等特點。海馬是神經元高度集中的部位，錐體神經元是海馬區的主要成分，體外培養的海馬神經元，對許多致病因素和化學損害較為敏感，因此在研究神經系統疾病的病理機制及治療方法中均以海馬作為病理模型，如缺血/缺氧

9、、癲癇、衰老和興奮性毒素等均可引海馬的特異性損害。在腦缺血模型中，海馬神經元最早出現較嚴重的損害，并且海馬缺血性損害和興奮性神經毒有關，這可能和海馬神經元含有高密度的谷氨酸能受體有關4。本研究采用胎鼠海馬神經元的無血清體外培養，獲得高純度的神經元。通過高分子量神經絲蛋白（neurofilament high molecular weight，NF-H）和神經膠質酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）染色，鑒定海馬神經元的純度；通過相差顯微鏡觀察谷氨酸對海馬神經元胞體及突起的影響；通過MTT檢測在不同濃度谷氨酸損傷后，不同時間海馬神經元存活率；同時

10、通過TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling），Hoe-chst比較損傷組和正常培養組凋亡率，探討谷氨酸對海馬神經元的損傷機制，為篩選抗谷氨酸興奮毒性藥物提供實驗模型。1   材料和方法1.1   材料   動物：采用健康孕1819天Sprague-Dawley (SD)大鼠，由南通大學實驗動物中心提供；抗體：抗GFAP、NF-H抗體購自Sigma公司；其他試劑和材料：Neuronbasal培養基、B27、DMEM培養基購自G

11、ibco公司，胰蛋白酶、Hoechst33342購自Sigma公司，TUNEL試劑盒購自Promega公司。1.2   方法1.2.1   海馬神經元的原代培養5   孕1819天SD大鼠復合麻醉劑麻醉，無菌條件下取胎鼠腦，置于解剖液中，解剖顯微鏡下仔細去除腦膜，取出雙側海馬，于0.125%的胰酶37 消化10 min，用完全培養基（90%DMEM+10%FBS）終止消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度大約為106/ml，接種于事先用多聚賴氨酸包被的24孔/96孔細胞培養板。4 h后換成無血清的神經元培養基（98 neurobasal

12、medium2B27）置5%CO2、飽和濕度、37 培養箱培養78天。3天半換液。1.2.2   免疫細胞化學   海馬神經元按上法培養7天后，吸去培養液，用PBS洗滌一次，加入4%多聚甲醛500 l，室溫下固定30 min，去除固定液，用PBS室溫下洗滌10 min×3次。用含10%羊血清、0.3% Triton X-100 的PBS液在37條件下封閉60 min，吸去封閉液。滴加一抗（rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，1200，rabbit anti-GFAP polyclonal antibody，

13、1300），4放置過夜，PBS洗。滴加二抗（FITC goat anti-rabbit IgG，1200），室溫、避光放置2 h，PBS洗。以Hoechst（5 g/ml）標記細胞核，PBS洗。實驗中設不加一抗的空白對照組，除以PBS代替rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，其余步驟同上。在激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光細胞化學檢測結果。隨機計數500個細胞，計算NF-H陽性細胞百分率。Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡時，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗細胞兩遍，各組加入Hoechst 33342染液（5 g/ml）室溫染色10 min

14、，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組凋亡細胞數。每組設3個復孔，每孔隨機取五個視野，實驗重復3次。1.2.3   海馬神經元谷氨酸損傷處理6   海馬神經元按上法培養78天后，吸出原來的培養基，用Locke's液洗滌細胞3次，每次5 min。 以Locke's液配制125 M谷氨酸，其中添加1 M甘氨酸。正常對照組（Locke's不含有125 M谷氨酸）和實驗組均作用15 min，撤除，再用Locke's液洗滌細胞3次，每次5 min。重新加入原來的培養基，繼續培養。1.2.4   MTT檢測 

15、60; 海馬神經元以1×106個/ml接種細胞于96孔培養板中，每孔0.1 ml。5%CO2培養箱中培養78天。加入谷氨酸損傷，分別于損傷后12 h、18 h、24 h。每孔加 10 l MTT（5 mg/ml）放入37 ，5% CO2培養箱中培養4 h。然后每孔加入100 l 20% SDS ，培養箱中培養20 h。酶標儀上570 nm(參考波長490 nm)處測定OD值。每個實驗組設8個復孔，實驗重復3次。1.2.5   TUNEL法檢測細胞凋亡7   海馬神經元在24孔板上按上法培養78天。實驗分2個實驗組進行，損傷組用125 M谷氨酸按上述損傷方法處理。谷氨酸處理后18 h吸去培養液，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，室溫下用新鮮PBS洗細胞兩遍。再用0.2%Triton