1、谷氨酰胺對缺血再灌注肝臟熱休克蛋白70基因表達的影響 作者：劉國平，馮曉東，朱聞溪，楊廣順，周文平，程廣明【摘要】 目的 探討谷氨酰胺（Gln）對缺血再灌注肝臟熱休克蛋白70（HSP70）基因表達的影響及其對肝臟的保護作用。方法 雄性Wistar大鼠120只，隨機分為3組（n40）：假手術組（1組）、生理鹽水組（2組）和谷氨酰胺組（3組）。術前3組大鼠連續5天腹腔注射Gln，2組僅給予等量的生理鹽水。2、3組采用Pringles法阻斷入肝血流，35 分鐘后開放復流，1組僅行麻醉、開腹。分別于阻斷前及再灌注后2、4、24小時，取血及肝組織，測定血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸

2、脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子（TNF）及肝組織丙二醛（MDA）的含量，采用RTPCR法檢測肝組織HSP70mRNA的表達。結果 再灌注后2、4、24小時，3組MDA、ALT、AST、LDH及TNF水平與2組相比均顯著降低（P<0.05），而3組肝組織HSP70mRNA表達顯著高于2組和1組（P<0.05）。結論 Gln能夠促進肝組織HSP70基因的表達，減輕肝缺血再灌注損傷，抑制炎癥因子釋放。 【關鍵詞】 熱休克蛋白70；谷氨酰胺；缺血再灌注；肝臟 Abstract： Objective To investigate the influence of Lglutamine on

3、the expression of HSP70mRNA in liver and its protective role against ischemia/reperfusion damage.Methods One hundred and twenty male Wistar rats were divided randomly to three groups(n=40): shamoperation group (group 1),saline group(group 2) and glutamine group (group 3).Rats in group 2 were pretrea

4、ted with 4ml 0.9% saline intraperitonally twice per day for 5 days consecutively.In group 3,rats were pretreated with Gln dissolved in 4ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day for 5 days consecutively.The rats of groups 2 and 3 underwent total hepatic inflow occlusion for 35min utes through t

5、he pringles method.Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion and at 2hours,4hours,24hours after reperfusion respectively.The levels of MDA in liver tissue were measured.The levels of serum TNF were detected.The serum concentrations of ALT,AST,LDH wer

6、e assayed on a standard biochemistry autoanalyser.The expression levels of HSP70mRNA in hepatic tissue were assessed by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Compared with group 2,the levels of MDA,ALT,AST,LDH and TNF in group 3 decreased significantly at 2hours,4hours,24hours afte

7、r reperfusion (P<0.05).The levels of HSP70mRNA expression in liver from group 3 were higher than those from group 1 and group 2 at 2hours,4hours,24hours after reperfusion(P<0.05).Conclusion Gln presupplement could alleviate the ischemia/reperfusion injury of liver and inhibit the release of pr

8、oinflammatory factors after the pringles method,which might be related with the role of Gln in promoting the expression of HSP70mRNA. Key words:HSP70;Lglutamine;ischemia reperfusion;liver 通過啟動內源性保護反應來增強肝臟本身的耐受性，是減輕缺血再灌注損傷最理想的方法。熱休克蛋白（HSP）是一種細胞自我保護性蛋白，促進HSP表達是啟動內源性保護反應的關鍵所在。目前，對于預防性應用谷氨酰胺（Gln）是否可促進HS

9、P70表達和減輕機體繼發性損害報告甚少，且存在著爭議1-3。其作用機制如何也不明確。因此，本研究擬探討Gln對缺血再灌注肝臟HSP70基因表達的影響及其作用。 材料與方法 1 實驗動物分組及處理 雄性Wistar大鼠120只，體重300350g ,隨機分為3組（n=40）：（1）假手術組（1組）；（2）生理鹽水組（2組）：生理鹽水4ml，腹腔注射，每天2次，連續5天；（3）谷氨酰胺組（3組）：Gln溶液（300mg/kg，用生理鹽水稀釋至4ml），腹腔注射，每天2次，連續5天。術前禁食12小時，自由飲水。所有動物均采用戊巴比妥鈉（3.5mg/100g）腹腔內注射進行麻醉。沿腹正中切口切開腹腔，

10、顯露第1肝門，采用Pringles法用無創血管夾阻斷肝十二指腸韌帶，持續35分鐘后，撤夾恢復血流。分別于缺血前及再灌注后2、4、24小時每組隨機選取10只大鼠，自心臟取血5ml,靜置20分鐘，4000r/min離心10分鐘，分離血清，-30保存待測。切取部分肝組織，置于-70中保存待測。1組除麻醉、開腹外不做任何處理。血清用于測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）及腫瘤壞死因子（TNF），肝組織用于丙二醛（MDA）及HSP70mRNA表達的測定。 2 主要試劑 LGln(上海康達氨基酸廠)；MDA及總蛋白定量試劑（雙縮脲）（南京建成生物研究所），試劑配置序號參照說

11、明書；TNF采用夾心法ELISA檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)測定；大鼠HSP70引物參照GenebankTaKaRa（大連）公司合成序列為（擴增片段為354bp）：5AACGTGCTGCGGATCATCAA3（上游引物）,5CTGGATGGACGTGTAGAAGT3（下游引物）；內參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物TaKaRa（大連）公司合成序列為（擴增片段為528bp）：5ACCACCATGGAGAAGGCCGG3（上游引物）,5CTCAGTGTAGCCCAGGATGC3（下游引物） ；Trizol總RNA提取試劑（美國Promega公司）；逆轉錄試劑盒、DNA Market(

12、M)及PCR擴增所需的其他試劑TaKaRa（大連）公司；電泳用聚丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）及瓊脂糖等（上海化工生物工程公司）。 3 檢測方法 血清ALT、AST、LDH含量采用島津CL7150全自動生化分析儀測定；血清TNF、肝臟MDA含量分別采用ELISA方法、硫代巴比妥酸法測定，操作步驟按試劑盒說明書進行；每組在各個時點分別隨機選取5只大鼠的肝標本，采用RTPCR法檢測肝組織HSP70mRNA的表達。 4 統計學處理 數據結果均以均值標準差表示，統計學差異性檢驗采用SPSS11.5統計軟件進行完全隨機設計方差分析，樣本之間采用LSD法進行兩兩比較。 結 果 1 血清ALT、LD

13、H、AST水平的變化 再灌注后2、4、24小時，3組ALT、LDH、AST水平明顯低于2組（P<0.05）；2組則明顯高于1組（P<0.05）（見表1）。 2 肝組織MDA水平的變化 再灌注后2、4、24小時，3組肝組織MDA水平明顯低于2組（P<0.05）。再灌注后2、4小時,2組MDA水平明顯高于1組（P<0.05），但再灌注后24小時兩組之間無顯著差異。與1組相比2組MDA水平明顯增高（P<0.05）（見表1）。 3 血清TNF水平的變化 再灌注后2、4、24小時，3組TNF水平明顯低于2組（P<0.05）；2、3組則明顯高于1組（P<0.05）

14、（見表1）。 4 各組大鼠肝組織HSP70mRNA表達的變化 術前：1、2組肝臟未見HSP70mRNA表達，而3組明顯表達（P<0.05）。再灌注后2、4、24小時：1組肝臟HSP70mRNA表達微弱，2組表達稍增強（P<0.05）， 3組表達顯著高于2組和1組（P<0.05）（見表2、圖1）。討 論 HSP是細胞應激蛋白的一種，細胞在受到急性非致死性刺激后，HSP基因即刻被激活，轉錄活性增強，細胞內可檢測出mRNA表達4，這最早發現于熱休克實驗中的果蠅唾液腺細胞中，后來證明，它是一種普遍存在于生物界中的能被多種損傷因素和應激因子誘導的細胞應激反應蛋白。HSP根據分子量不同而

15、命名為HSP70、HSP90、HSP27等。對于哺乳動物，HSP70是其中重要的活性成分，它可以被各種物理、化學、生物等刺激所誘導，產生非特異性保護作用。這是因為HSP70作為一種“分子伴侶”，可使應激損害所造成的變性蛋白質重新正確折疊得以修復，或指導它們進一步降解，防止在細胞內積聚而致細胞損傷。 盡管許多方法和藥物可誘導HSP產生，但在臨床實際中，由于受到劑量、毒副作用、誘導效率等許多條件的限制而得不到應用。本研究結果顯示預防性給予Gln，肝臟HSP70mRNA表達水平明顯提高。這表明Gln具有促進HSP70基因轉錄的效應。在缺血再灌注損傷中HSP具有保護作用，其機制可能與下列因素有關：（1

16、）抑制中性粒細胞浸潤5；（2）調節白細胞與內皮細胞間的相互作用6；（3）提高細胞的抗氧化能力7；（4）減少炎性介質的生成8,如TNF等；（5）HSP70還可能調節NO的生成9。本研究發現在肝臟缺血再灌注前預防性給予Gln，可減輕再灌注后的脂質過氧化損傷，降低轉氨酶水平，抑制TNF的釋放，說明Gln在肝缺血再灌注損傷中起保護作用,這可能與Gln促進HSP70mRNA的表達關系密切。因為Gln是一種人體正常需要的氨基酸，對人體無毒，臨床中已廣泛應用。所以，在缺血再灌注前給予Gln誘導HSP70以提高機體自身的耐受性，對減輕肝臟損傷，減少并發癥，改善預后具有積極的臨床意義。 目前對于Gln誘導HSP

17、還存在著爭議1-3，各研究結果之間的差異可能與Gln的劑量、應用時間、所作用的組織及動物種屬有關。關于Gln誘導HSP的機制仍不清楚，該效應是由Gln本身還是其代謝產物作用的結果，仍有待深入研究。【參考文獻】 1Singleton KD,Serkova NP,Beckey VE,et al.Glutamine attenuates lung injury and improves survival after sepsis:role of enhanced heat shock protein expressionJ.Crit Care Med， 2005,33（6）:1206-1213.2

18、Pollheimer J,Zellner M,Eliasen MM,et al.Increased susceptibility of Glutamine-depleted monocytes to fever-range hyperthermia:the role of 70-kDa heat shock proteinJ.Ann Surg，2005,241（2）:349-355.3Wischmeyer PE,Kahana M,Wolfson R,et al.Glutamine induces heat shock protein and protects against endotoxin

19、 shock in the ratJ.J Appl Physiol，2001,90（6）:2403-2410.4Villar J,Mendez-alvarez S,Heat shock proteins and ventilator-induced lung injuryJ.Curr Opin Crit Care，2003,9（1）:9-14.5Stojadinovic A,Kiang J,Goldhill J,et al.Induction of the heat shock response prevents tissue injury during acute inflammation of the rat ileumJ.Crit Care Med，1997,25（2）:309-317.6Chen G,Kelly C,Stokes K,et al. Induction of heat-shock protein72kDa expression is asso