1、CACNA1F基因在3T3-L1脂肪細胞誘導分化過程中表達變化的研究 作者：劉勇 郭錫熔 潘曉勤 倪毓輝 陳榮華【摘要】 目的 觀察3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化過程中L-型電壓依賴鈣離子通道1F亞基(CACNA1F)基因表達水平的變化，探討CACNA1F基因與肥胖發生的關系。方法 體外培養3T3-L1前體脂肪細胞，在誘導3T3-L1脂肪細胞分化成熟的不同時段，采用RT-PCR技術檢測脂肪細胞中CACNA1F基因的mRNA表達水平。結果 CACNA1F基因在脂肪前體細胞中表達水平較低，隨著脂肪細胞的分化成熟該基因表達水平逐漸升高，至分化第810天達到高峰。進一步的統計分析發現，CACNA1F

2、基因的表達水平在細胞分化第03天、56天、810天3個時間段內無明顯變化外(P0.05)，其余各時間段之間的表達水平差異均有顯著性(P0.05)。結論 CACNA1F基因參與了脂肪細胞分化的調控，與肥胖發生相關，其在3T3-L1細胞分化過程中的表達變化可能有利于脂肪細胞的分化成熟和脂質積聚。 【關鍵詞】 CACNA1F基因 3T3-L1前體脂肪細胞 細胞分化. 【Abstract】 Objective To investigate the changes of L-type voltage-dependent calcium channel 1F(CACNA1F)gene expression

3、 during 3T3-L1 preadipocyte differentiation.To explore the relationship between CACNA1F gene and the etiology of obesity.Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the matured adipocytes.Total RNA was extracted from adipocytes of various times and the levels of CACNA

4、1F gene mRNA expression were evaluated by RT-PCR.Results In preadipocye，the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained at low.In the presence of inducing reagents，the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in the mature adipocyte.There was a s

5、ignificant difference between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression ，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day，5th to 6th day，8th to 10th day.Conclusion CACNA1F gene is involved in the differentiation of adipoc

6、ytes and related to the etiology of obesity.The changes in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogenesis of adipocytes. 【Key words】 L-type voltage-dependent calcium channel 1F gene 3T3-L1 preadipocyt

7、e cell differentiation 近年來，我國兒童肥胖的發病率逐漸上升，而且與肥胖相關的一些疾病，如高血壓、高脂血癥、2型糖尿病等越來越多地出現在兒童群體中，肥胖已成為危害兒童身心健康的嚴重醫學問題；然而肥胖病因復雜，是機體在遺傳、環境、行為、生理、社會、文化等諸多因素相互作用下能量代謝失衡的結果，因此防治難度極大，一些傳統的肥胖治療方法如控制飲食、減肥藥物等收效甚微，而且由于兒童正處于身心發育的關鍵時期，這些方法在兒童中的應用受到限制，因此迫切需要尋找安全有效的肥胖控制治療方法。鈣是飲食中一種重要的成分，自從十多年前人們發現肥胖病人體內脂肪細胞中鈣離子濃度升高以來，鈣與肥胖的關系

8、逐漸成為一個研究熱點，為尋找控制肥胖及其相關疾病的治療方法開拓了一片嶄新的視野。研究表明，細胞內鈣離子濃度在與肥胖相關的能量代謝失衡中起關鍵作用。細胞內鈣離子在調控脂肪細胞脂質代謝和甘油三酯沉積中起著重要作用，細胞內鈣離子濃度的增加導致脂肪合成基因的表達和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最終增加脂肪積聚而導致肥胖。低鈣飲食可導致1，25-二羥維生素D3的產生增加，刺激鈣離子在細胞內流動從而促進肥胖的發生；而高鈣飲食可以減少脂肪細胞脂質積聚，增加脂質分解，控制體重增加1，2。在這個過程中，鈣離子通道介導的鈣離子細胞內流是一個重要環節。因此圍繞著鈣離子通道及其調控因素開展進一步的研究具有重要的意義。

9、由于在先前研究中3，應用cDNA array技術發現，L型電壓依賴鈣離子通道1F(L-type voltage-dependent calcium channel 1F，CACNA1F)基因差異表達于肥胖和正常大鼠的脂肪組織中，肥胖狀態下該基因表達顯著上調，提示該基因表達變化與肥胖發生密切相關。為進一步研究該基因與肥胖之間的關系，本研究在成功誘導3T3-L1前體脂肪細胞分化成熟的基礎上，采用RT-PCR技術觀察CACNA1F基因在前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化過程中表達水平的變化，以探討該基因與脂肪細胞分化及肥胖之間的關系。 1 材料與方法 1.1 材料 3T3-L1前體脂肪細胞株由上海中科院

10、生物化學與細胞生物學研究所廖侃教授饋贈，本實驗室傳代留種，DMEM培養基、胰蛋白酶、TRIzol購自美國Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰島素、地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)、DEPC購自美國Sigma公司，油紅O(oil red-O)染料購自上海化學試劑廠。dNTP、M-MLV逆轉錄酶、Oligo(dT)18、Ex-Taq酶等分子生物學試劑購自美國Promega公司，PCR Marker購自華美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技術有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 3T3-L1前體脂

11、肪細胞培養和誘導分化 根據3T3-L1細胞培養和誘導分化方案4，用完全培養液(DMEM+10%FBS+100u/ml青、鏈霉素)，在37孵箱(5%二氧化碳，95%空氣)中培養細胞，每2天換液1次。待細胞生長至完全融合后2天(第0天)，開始誘導分化，具體步驟為：將培養液換成含0.5mmol/L MIX、1mol/L地塞米松和5mg/L胰島素的完全培養液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培養液中只含有5mg/L胰島素；2天后換液，撤去胰島素，使用不含有任何誘導劑的完全培養基；以后每2天換液1次，直至第10天95%以上細胞已分化為成熟的脂肪細胞。收集分化不同時間段(010天)的細胞，置-70凍

12、存備用。 1.2.2 3T3-L1細胞鑒定 油紅O染料經異丙醇溶解后過濾，置4備用。取分化不同時間段(010天)的細胞，先用0.01M PBS洗2遍，加入3.7%甲醛固定2min，再用清水洗凈，加入油紅O染液染1h，水洗至背景透明。經油紅O染色、蘇木素復染，顯微鏡下觀察結果，細胞質中脂滴呈亮紅色、細胞核呈藍色。拍照，記錄細胞的分化情況。 1.2.3 RT-PCR方法檢測3T3-L1細胞中CACNA1F基因mRNA的表達水平 取細胞200l(約4×105個細胞)，TRizol法提取3T3-L1細胞的總RNA，定量后取1g，以Oligo(dT)18為引物進行逆轉錄，反應體系20l。取逆轉

13、錄產物1l為模板進行PCR擴增，PCR反應體系20l。小鼠CACNA1F基因的上游引物序列：5-ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3，下游引物序列：5-CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3，產物長度987bp；內參照小鼠GAPDH基因的上游引物序列：5-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3，下游引物序列：5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3，產物長度432bp。PCR反應條件為：預變性95 2min，變性94 30s，退火52 30s(GAPDH基因：52 30s)，延伸72 30s，共30個循環(GAPDH基

14、因：30個循環)，終末延伸72 5min。所選用PCR反應的模板量及循環數均使PCR產物量位于反應曲線的線性范圍內。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用UVP凝膠密度掃描儀對CACNA1F基因和CAPDH特異性擴增產物的電泳條帶進行密度掃描，用Labwork 3.0軟件測定電泳條帶密度值，CACNA1F基因mRNA的表達水平以該基因條帶密度占GAPDH基因條帶密度的百分比(%)表示。 1.3 統計學方法 數據均以均數±標準差(x±s)表示，用Excel統計軟件和SPSS 10.0統計軟件進行數據整理和統計。多組間均數比較采用方差分析F檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P0.

15、05示結果具有統計學意義。 2 結果 2.1 細胞染色鑒定結果 誘導分化前，3T3-L1前體脂肪細胞呈梭形成纖維細胞形態，細胞核呈藍色，細胞質內未見亮紅色顆粒；細胞生長至完全融合后2天(第0天)開始誘導分化，第2天到第6天細胞形態發生明顯變化，細胞逐漸由梭形變為圓形，胞體變大變圓，細胞質內被油紅O染成亮紅色的脂滴逐漸增多增大；第6天時，約60%的細胞已分化成熟；第10天時，可見含有亮紅色脂滴的成熟脂肪細胞在視野中占95%以上，細胞體積大、形態圓。 2.2 3T3-L1脂肪細胞誘導分化過程中CACNA1F基因表達水平的變化 見圖1、圖2、表1。由圖表可見，CACNA1F基因在脂肪前體細胞中表達水

16、平較低，隨著脂肪細胞的分化成熟該基因表達水平逐漸升高，至分化第810天達到高峰。進一步的統計分析發現，CACNA1F基因的表達水平在細胞分化第03天、56天、810天3個時間段內無明顯變化外(P0.05)，其余各時間段之間的表達水平差異均有顯著性(P0.05)。 圖1 3T3-L1脂肪細胞分化中CACNA1F基因表達水平的檢測(M：PCR Markers，010：細胞分化時間) 圖2 3T3-L1脂肪細胞分化中CACNA1F基因表達水平的變化 表1 3T3-L1細胞誘導分化過程中CACNA1F基因的表達水平 (x±s，%) 注：與第510天各組比較：P均0.01；與第5天比較：P0.

17、05；與第610天各組比較：P均0.01；與第6天比較：P0.05；與第710天各組比較：P0.01；與第7天比較：P0.05；與第810天各組比較：P均0.01；細胞數約4×105 3 討論 CACNA1F基因編碼L型電壓依賴型鈣離子通道的一種1亞基1F，既往研究發現其主要表達于視網膜光感受器細胞上，介導鈣離子細胞內流，該基因的突變可導致人類遺傳性不完全性聯夜盲癥(incomplete X-linked congenital stationary night blindness，iCSNB2)5。L型鈣離子通道由1、2、等多條多肽亞基組成，其中1亞基是最重要的功能單位，它形成鈣離子

18、跨膜流通的孔洞通道，既具有離子選擇性，又是電壓感受器，同時也是鈣拮抗劑等大多數藥物的結合位點；位于膜內的亞基、位于膜外的2亞基及跨膜的亞基共同組成鈣離子通道的附屬部分，起著調控鈣離子通道的作用68。1有多種類型，由1F亞基組成的鈣離子通道又被命名為CaV1.49。CaV1.4具有以下一些功能特點：它激活快、失活較慢、激活的閾電位較低、對DHP(dihydropyridine，二氫嘧啶，一種鈣離子通道拮抗劑)的中度敏感性以及沒有Ca2+誘導的失活過程10。 本研究通過3T3-L1脂肪前體細胞體外培養研究首次發現，CACNA1F基因也表達于3T3-L1脂肪前體細胞的誘導分化過程中，并且隨著細胞的分

19、化成熟，其表達水平之間增高，而且其表達增高的趨勢與細胞脂質積聚過程呈現較好的一致性。由此現象推測，CACNA1F基因的功能與脂肪細胞的成熟及脂質積聚有關，即該基因參與了脂肪細胞的分化過程。隨著脂肪前體細胞的分化進程，CACNA1F基因的表達逐漸上調，細胞膜表面鈣離子通道的數量逐漸增加，其介導的鈣離子內流增加，細胞內鈣離子濃度上升，促進了脂肪細胞的分化以及脂質積聚。進一步的統計分析發現，CACNA1F基因在細胞分化的03天表達水平并無明顯變化。至35天時其表達水平才開始有顯著上升，這可能與03天時細胞尚處于克隆性增殖階段(DNA復制階段，將提供更多基因啟動位點以促進細胞分化)有關11。第3天起，

20、CACNA1F基因的表達水平開始顯著上升，同時細胞的形態也由類似成纖維細胞的不規則型轉變為圓形，細胞內脂質合成逐漸增加，至810天，CACNA1F基因表達水平趨于平穩，則可能與細胞已分化成熟、進入終末分化階段有關。 【參考文獻】 1 Zemel MB，Miller SL.Dietary calcium and dairy modulation of adiposity and obesity risk.Nutr Rev，2004，62(4)：125-131. 2 Zemel MB.Nutritional and endocrine modulation of intracellular cal

21、cium：implications in obesity，insulin resistance and hypertention.Mol Cell Biochem，1998，188(1-2)：129-136. 3 龔海霞，郭錫熔，陳榮華，等.肥胖大鼠脂肪組織基因表達譜系研究.中華醫學遺傳學雜志，2003，20(3)：268-271. 4 Ntambi JM，Kim YC.Adipocyte differentiation and gene expression.J Nutr，2000，130(12)：3122S-3126S. 5 Morgans CW，Gaughwin P，Maleszka R.Expession of the 1F calcium channel subunit by photoreceptors in the rat retina.Molecular Vision，2001，7：202-209. 6 曹立珍，譚煥然.L型鈣離子通道1亞單位的分子生物學研究進展.中國藥理學通報，1998，14(6)：484-487. 7 Yamakage M，Namiki A.Cal