1、脾臟單個(gè)核細(xì)胞的制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞的制備: 將 5 只小鼠斷頸椎處死, 無菌取出脾臟, 分別剪碎, 置 200目無菌尼龍網(wǎng)上, 分次滴入4 5 ml RPMI1640 培養(yǎng)液 , 輕輕研磨脾臟, 直到脾臟變白;收集細(xì)胞懸液( 由于紅細(xì)胞所占比例很低且對(duì)實(shí)驗(yàn)影響不大, 故無需作紅細(xì)胞裂解處理) ,1 000 r/ min( 離心半徑17. 5 cm) 離心 5 min, 棄上清 ; 加入 2 ml pH7. 4 的 PBS, 混勻后 1 000 r/ min( 離心半徑17. 5 cm) 離心 5min, 棄上清 ; 加入 4 ml RPMI1640 培養(yǎng)液，混勻，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋2

2、00倍后滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用RPMI1640將細(xì)胞懸液調(diào)成2 X 10 / 300 m 的濃度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠 脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子刺激方案的篩選單細(xì)胞懸液的制備：將大鼠頸椎脫位處死后, 置 70%乙醇中浸泡5 m in, 無菌取出脾臟和胸腺置于平皿中, 除掉結(jié)締組織, 用生理鹽水清洗3 次。加入2 mL RPM I- 1640 完全培養(yǎng)液, 用剪刀分別將脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎塊后 , 用毛玻片輕柔研磨組織碎片 , 經(jīng) 8 層紗布過濾制成單細(xì)胞懸液, 經(jīng) H anks 液離心洗滌后, 將細(xì)胞懸浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培養(yǎng)液。

3、臺(tái)盼藍(lán)染色, 計(jì)數(shù)活細(xì)胞在95%以上, 調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5X 10 cells /L 。粗江籬多糖對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞周期的影響610制備脾細(xì)胞懸液脾淋巴細(xì)胞的獲取手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等手術(shù)器械,300 目尼龍網(wǎng)等須經(jīng)消毒處理; 以頸椎脫臼法處死小鼠, 用 7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。沿腹腔中線剪開小鼠胸腔, 取出脾臟置于培養(yǎng)皿中, 剪去脂肪和筋膜組織, 用 R PMI-1640 培養(yǎng)液漂洗。粗剪成小塊, 用注射器芯輕輕擠壓, 加人基礎(chǔ)培養(yǎng)液, 混懸 , 用 300 目尼龍網(wǎng)過濾到玻璃離心管中, 再加人基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗網(wǎng)上剩余組織細(xì)胞。收集濾過的細(xì)胞懸液, 加人 0.83 % 的

4、氯化銨到濾過的細(xì)胞中, 靜置 5 min , 以除去血紅細(xì)胞。用RPM-ll640 培養(yǎng)液離心( 2500r/min,10min) 洗滌細(xì)胞3 次 , 以除去剩余的氯化銨將上述收集到的脾臟細(xì)胞置于玻璃培養(yǎng)瓶中 , 在 37 、 5 % C O: 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h , 以除去貼壁細(xì)胞, 收集未貼壁的細(xì)胞懸液即獲得脾淋巴細(xì)胞。計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù), 活細(xì)胞數(shù)大于95 % 。從Ca2+1路研究紫草多糖促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)制14 日齡健康雞，無菌取脾臟，Hanks' 液洗 3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心( 1000r/min) ，棄上清，

5、Tris-NH4Cl 破解紅細(xì)胞，冰水浴放置10min,離心(1000 r /min) ,棄上清，Hanks'液洗3次。加入無酚紅 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 10 cell /mL 。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。馬尾藻多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激影響的實(shí)驗(yàn)觀察61. 3 鼠脾淋巴細(xì)胞的制備小鼠脫頸處死, 于 75%酒精中浸泡5 min, 在超凈工作臺(tái)中無菌打開腹腔, 取出脾臟, 用含有高濃度青鏈霉素（ 青霉素 300 IU/ ml+ 鏈霉素300 w g/ ml）的PBS液洗滌2-3次，剝?nèi)テ⑴K周圍結(jié)締組織。將處理好的脾臟移入一無菌青霉素瓶中, 加入適量的R

6、PMI1640 完全培養(yǎng)液（ RPMI1640+ 10%胎牛血清+ 青霉素 100IU/ml+ 鏈霉素100 g /ml）, 眼科剪剪碎,400目網(wǎng)篩過濾，收集濾液并疊加于等體積的小鼠淋巴細(xì)胞分離液上, 2000 rpm 離心 15 min 。用無菌吸管取灰白層, 加入適量RPMI1640 完全培養(yǎng)液后, 1 000 rpm 離心 5 min 、去上清液, 用適量 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 取微量重懸細(xì)胞液, 加等體6 積 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液, 染色 2 min, 計(jì)數(shù)活細(xì)胞后, 用 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X10 /ml（ 細(xì)胞活率95%以上） ,

7、備用。苯對(duì)母鼠和子鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡影響2. 3. 2 脾淋巴細(xì)胞增殖功能檢測(cè)。處死小鼠后, 各取脾臟8 個(gè) , 輕輕研磨成勻漿200 目篩網(wǎng)過濾, 制備脾細(xì)胞懸液, 離心 , 1500 rm10m in, 棄上清 , 加入適量紅細(xì)胞裂解液 （ 1m l 懸液中加3m l）, 螺旋震蕩3m in,6PBS 洗2次，含10%9臺(tái)牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2X10 /ml 加入 96 孔 U 型培養(yǎng)板中,每孔100 l。分別加入 ConA （ 10 g /m l） 100 l使其終濃度為 5 g /ml每個(gè)標(biāo) 本3個(gè)復(fù)孔，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 64h,培養(yǎng)結(jié)束

8、前4h加入MTT（ 5mg /ml） 20 以 培養(yǎng) 結(jié)束后離心1500 rm10m in, 小心吸去上清，力口入DMSO15（0l振蕩10m in,酶標(biāo)儀 550nm檢測(cè)各孔吸光度（OD值）。復(fù)方阿膠漿對(duì)移植性肺癌小鼠脾、胸腺重量指數(shù)與脾淋 巴細(xì)胞增殖影響1. 2. 2 淋巴細(xì)胞懸液制備分離小鼠的派氏結(jié)（ Peyer S patches, PPs） , 腸系膜淋巴結(jié) （ mesenteric lymph nodes, MLNs） , 脾臟 （ Spleen, SP） , 分別置于3 個(gè)盛有預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用研磨棒加適度力度輕輕研磨，于200目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以冷

9、PBS洗滌細(xì)胞兩次（1 200 r/ min, 57 分鐘），脾細(xì)胞以低滲法裂解紅細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋到1X10cells/ ml 。茯苓多糖對(duì)免疫抑制小鼠粘膜淋巴組織及脾臟中 CD3+和CD19+細(xì)胞變化的影響1.4.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定小鼠頸椎脫臼處死，無菌取出脾臟，置盛有適量無菌Hank' s液的小平皿中，用眼科剪輕輕將脾臟剪碎，經(jīng) 200目篩網(wǎng)碾碎過濾，制成單細(xì)胞懸液，用Hank's 液洗 3 次，每次離心10 min （ 1 000 r/min ），去上清后加入預(yù)冷的 0.83%Tris-NH4Cl 裂解紅細(xì)胞1 min ，再用 1640 培養(yǎng)液洗滌2-3 次，然后將細(xì)胞懸浮于2 mL完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0 X 106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 L,每組重復(fù)3孔（見表2）,各補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至 200 L。置5%CO裝養(yǎng)箱37 C培養(yǎng)72 h ,培養(yǎng)結(jié)束前 4 h ,棄去上清液, 加入100 L不含胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入 MTT(5 mg/mL) 10 L/孔， 繼續(xù)培養(yǎng)4