1、從患者開始談基因檢測的整個流程題記：幾顆玉米放進爆米花機器,由來便是爆米花；一 個智力一般的高中生放到人大附中,三年后由來就是國際一 流大學新生；二兩五花肉和幾個青椒交給一名廚師,由來的 便是香噴噴的回鍋肉.可是這中間都發生了啥是什么重要 步驟將初始原料打磨成了成品10ml的血液或者一塊腫瘤組織,最終變成了一份20頁的檢測報告這是怎么實現的 中間都發生了什么本文旨在答復這個問題.基因檢測的整個流程可分為哪幾個大的步驟概況性地了 解一個事務的框架是很有必要的,由于這樣我們心里會有“底.不管別人怎么分,我簡單粗暴地把它分為四個程序： 1,檢測前咨詢局部；2,實驗室局部；3,信息分析局部；4, 臨床

2、解讀局部.五臟俱全的基因檢測公司應該包含以上所有 的四個程序,除非存在局部業務外包的情況,例如有的公司 只做臨床解讀局部.1檢測前咨詢局部：不是所有的癌癥 患者都應該檢測,都值得檢測,檢測目的是為了明確是否可 以使用靶向藥物,還是僅僅為了玩,選擇哪種產品更加適合, 這些都是需要在這局部搞清楚.2實驗局部：應該取多少組織樣本,測序過程中有哪些細節步驟, 這可是個核心環節. 3信息分析：實驗局部做完以后所得到的是一大堆序列, 不分析就是一堆垃圾,信息部要做的就是從這些垃圾中挑選黃金.4臨床解讀：黃金挑選由來不拿去換成大米然后進 肚,那也沒什么用,基因檢測的結果有什么意義,對臨床實 踐又何指導,全在

3、這里了.四個程序,每個程序又包含哪些 小工序呢通過上面的介紹,我們可以大體了解基因檢測分 為四個程序,也明白四個程序主要做什么.可是,每一個程 序又具體涉與哪些小程序呢剖析程序的過程,就是知識差 異化的過程.1,檢測前咨詢：患者預期、產品選擇；2,實驗局部：樣本獲取與運輸、 DNA®備與文庫構建、質控與上 機測序；3,信息分析局部：數據分析、報告初稿；4,臨床解讀局部：檢測報告、臨床實踐、報告解讀/人文關心.總而言之,簡單來說,從明確患者的檢測目的開始 用藥指導, 耐藥后尋找新的方案,僅檢測一個基因或多個基因突變狀態 等,到選擇適宜的產品,然后獲取規X的樣本血液,組織,唾液等,然后適

4、宜的運輸方式到達實驗室,然后一些 列的規X實驗室操作與數據分析,最后到科學的檢測報告與 咨詢效勞.這就是四個程序所包含的內容.每一個程序分為 許多小工序,每一個小工序又有許多學問與講究.下面將會 詳細介紹每一個小工序.程序一：檢測前咨詢局部1.1 :患者預期.銷售經理、產品經理、主治醫生與患者需要充分溝 通,明確該基因檢測的目的,知道檢測技術的局限性,做好 患者的預期限制.1.2 :產品選擇.對于基因檢測產品來說, 產品選擇幾乎等同于檢測基因的選擇.哪些基因需要強行檢 測、哪些基因推薦檢測、哪些基因有一定的檢測價值,這些 需要闡述清楚.最后,根據患者的經濟情況與病情,綜合選 擇這是理想狀況.實

5、際操作過程中,銷售經理往往會以 經濟利益為導向.1.3 :臨床信息.患者的臨床信息對于基 因檢測報告者有重要意義,信息掌握越全面報告越個性化, 咨詢解讀也更有針對性.因此,完整詳實的臨床申請單需要 提供.程序二：實驗局部2.1 :樣本類型.需要明確一點,能夠運用無創的盡量用無 創唾液與血液,由于沒有一個患者希望無緣無故的在自 己身上打洞.固體：手術樣本,穿刺樣本,石蠟包埋組織, 石蠟切片組織；液體：全血,血清 血細胞,胸水,腹水, 唾液.1手術樣本：腫瘤組織A 50mg,癌旁正常組織A 25mg, 收到組織后立即用至少 5倍體積的10W性福爾馬林固定液 固定,切片25X以上,厚度5以m,腫瘤細

6、月占比A 50% 壞死組織區域2穿刺樣本：穿刺一針以上,腫瘤細胞占比 >50%壞死組織區域3石蠟包埋組織：常溫保存運輸即可, 最好是1年以內.4石蠟切片組織：常溫保存運輸即可, 最好是6周以內.5全血：6ml-10ml for NGS Streck 管, 含有保存液,負壓真空抽滿,輕輕垂直平面90旋轉10次, 6-25 C常溫運輸,37日內送達,可用干冰/制熱劑 制造維持環境溫度.6血漿 血細胞 普通試管：抽血后 2h內將全血4 c 1600g離心10min ,分別收集上清和沉淀至離心管中；上清再 4 °以g DNA, DNA勺OD 260/280在 1.8-2.0 之間,RN

7、A勺RIN值A 8.0.實驗中發現,只要 RIN 值大于7,就可以獲得比較滿意的結果.RIN: RN杭整值. 總的來說,質控兩個指標：1足夠的DNAS; 2完整的DNA 基因組.這個步驟在構建文庫后上機測序前完成.2.3 :文庫構建.簡而言之,獲取足夠量的 /目的的/前期適合上機測 序而標準處理的DNA其程序主要有：片段化,連接,擴增.1片段化：我們總不能直接將那么長的DNAfc測序吧,測序儀就只能一次測幾百 bp的DNA超聲波片段化等方法,獲 得DNA>t段為正態分布200-500bp ,通過一定方法切割瓊 脂糖凝膠電泳條帶選擇所需長度的DNA>t段150-200bp, 其它的片

8、段就扔了不影響覆蓋X圍.2末端修補：上面的方法物理方法片段化的DNA 一般來說兩端都被破壞了,不再是平平整整的了,而后續步驟需要在兩端加測序接 頭,所以我們得先把這個破壞的兩端修補好.修補所需三種 酶：5 '端延伸的酶,5'端連接的酶,3 '端延伸的酶.3 3'端加A:片段化且兩端修補好的 DNA 3 '端加上一個堿 基A,而下一步驟白連接接頭 3'端有一個堿基T,這樣就實 現了堿基互補而連接起來了.這樣做還有以下幾個原因：提 供連接效率；預防接頭與 DNA>t段多種方向連接；減少接頭 之間的連接.值得一提的是123的步驟可以用 WGSFr

9、amentation Mix 搞定.4兩端加接頭：首先明確接頭 3'端有一個突生的堿基 插入片段3'端有一個突生的堿 基A;其次,這個工序是在插入片段兩端參加東西；這個東 西包括以下幾個局部：測序接頭 P5, P7;測序時用于與種 植在Flow Cell上的序列堿基互補配對用,Barcode用于 標識該條DNA>t段屬于哪個樣本,4個堿基,單分子編碼序 列Index,用于識別是哪條 DNA>t段,12個隨機堿基；具 中Y型的序列是已經商業化的試劑盒.5PCRW集：如果樣本不夠,那么我們就需要擴增它才能上機測序,這就是該環 節存在的必要.由于每個經4處理的片段兩端都有

10、 P5與P7,因此PCR引物只需設計與它們配對的就行了.如果樣本 足夠,這一步就省了唄.6文庫定量：這里才應該是質控, 也就是2.2的步驟.7基因捕獲：我們只將需要的DNA/段去測序,不需要的去測不是浪費錢嗎于是在測序之前, 我們就用這個工序將目的DNMK選生來為什么要捕獲；目前目標序列捕獲方法有3種,NimbleGesn SequenceCapture array , Agilent SureSelect DNA Capture Array , Agilent SureSelect Target Enrichment System , 值得注 意的是不同捕獲方法可能測序儀器有不同的要求捕獲的

11、方 法有哪些；羅氏和安捷倫；我們捕獲的探針設計可以自己 設計,初步設計,需要檢測的位點提交到商業公司,真正的 設計還是需要專業的商業公司來干捕獲探針的由來；例如目標區域為100Kb,好的探針是100%!蓋這100Kb,而有的商業公司達不到,只能覆蓋到97%那么意味著有3%勺區域捕獲不到,更談不上對這些區域測序了,所以覆蓋率很重 要；對于這100Kb的目標片段,前10Kb探針捕獲了 100個 片段,第10Kb-20Kb的探針捕獲了 10個片段,那么這樣的 話就是均一性不好,最終可能會得由結論10Kb-20Kb這一段突變頻率過高/過低,因此均一性很重要；如果一個探針設 計由來想捕獲目標片段,卻捕獲

12、到了別的垃圾片段,我們還 對它測序,這不是浪費錢嗎所以,探針特異性很重要.好的捕獲是怎么樣的.8PCRT增：PCR再次擴增捕獲的 DNA 片段,上機前再一次加足樣本量.9文庫再次定量：相當于上機前的再一次質量檢測.2.4 :上機測序.通過前面的步驟,我們從患者身上的一塊腫瘤組織或者一管血開始,然 后別離提純我們需要的基因組DNA再把這些DNA丁成小片段,然后再在這些DNM、片段兩頭接上識別標記和測序接頭, 最后再通過基因捕獲技術篩選由目的DNA根據需求PCRT增.通過這么多步驟,就是為上機測序做準備.一句話,上 機測序的過程就是讀取這些DNA、片段的序列,如ATCTGGCTT.(160bp),

13、這樣萬級、億級的 DNA>t段個數. 至于這些DNA>t段是怎么樣在機器上被測由來的,這又是個 大問題,我在?液體活檢有哪些?這篇文章有簡要說明,這 里不管它,畢竟世界上那么多事情,哪有想管就管得了的 呢至此,實驗局部完畢.程序三：信息分析局部3.1 :下機數據識別.數以億計的DNM、片段,一大餅,雜亂無章,很多情況是幾十個患者的樣本都一起的,更亂.一 句話,這個步驟將屬于不同患者的DNM、片段放進不同的盒子里,分類.這是怎么實現的呢我們在構建文庫的加接頭 步驟時,同時加上了 Barcode序列,同一個患者使用同一個 Barcode,不同的患者使用不同的 Barcode,那么計算機

14、通過 這個Barcode輕松識別然后放進不同的盒子里.值得注意的 是,DNA兩條鏈,有的公司會兩條鏈同時測序以增加準確 性,因此一個A患者會有兩個盒子屬于他 A1:正義鏈的DNA 小片段集合；A2:反義鏈的DNA、片段集合.還值得注意 的是,如果樣本是血液,有的公司會同時檢測 cfDNA和gDNA 那么一個B患者就會有四個盒子屬于他B1, B2, B3, B4. 3.2 :圖像轉換.下機的時候那些DNA>t段最初其實是圖像格式的,例如紅色表示堿基 A,綠色表示堿基 T,需要用專 業工具將圖像格式轉換成序列.Illumina 公司提供專業軟件,只需對其調用就可以完成這一步驟.一句話：圖像轉

15、換 成序列.3.3 :比對到基因圖上.將這些上以億級的DNA、片段歸位,如果你是1號染色體的第500位到第650位之間 的片段,就把你歸到這個位置下面.當然,1號染色體上的這個位置下面一般不止一條 DNAt段,畢竟有一個概念叫做 測序深度,如果測序深度為10000,那么理論上該位置下面就應該有10000條DNA>t段.怎么限制是10000條呢這在 上機之前構建文庫時,通過調節PCRT增來實現.一句話：將散亂的DNM、片段比對到參考基因組上,從而實現它們的 定位.這個參考基因組是國際權威數據庫給由的,供給全世 界所有人使用.基因組：/golde

16、nPath/hg19/bigZips/ ;比 對軟件 BWA bio- ; 3.4 :計算突變頻 率.假設1號染色體的500位到第650位有10000個DNA>t 段,那么測序深度就真的是10000嗎在這里需要做一個區分,如果這10000條DNA片段有9000條是一模一樣的,那 么我們認為這是一條 DNA片段PCRT增由來的,這9000條 只能算作1條,這時候有效測序深度為 1001.在某個特定的 位點,如果這1001條DNA>t段有100條發生同樣的與參考 基因組不一樣的變化,我們就認為該點的突變頻率為10%這10%勺突變頻率血液腫瘤驅動基因突變為例意味著： 血液中的cfDNA有10猾ctDNA,從而反響患者的腫瘤病灶 有一局部癌細胞發生了該突變,假設有針對該位點的靶向 藥,那么可根據情況推薦使用.值得注意的是,如果有效測 序深度只有100,那么就有可能漏掉一些典型的突變,所以 有效測序深度足夠是非常重要的.這里有一個問題：某個特 定位點的變化,怎么樣才算真正的突變呢冷泉港實驗室的 VarScan軟件來判定 SNW INDEL,順便說一句要判定真正的突變很難,國際上有不同