1、多莉多莉克隆猴克隆猴動物克隆的技術基礎是動物的細動物克隆的技術基礎是動物的細胞和組織培養胞和組織培養 動物細胞培養動物細胞培養: :就是從動物機體中就是從動物機體中取出相關的組織取出相關的組織, ,將它分散成單個將它分散成單個細胞，然后細胞，然后, ,放在適宜的培養基中放在適宜的培養基中, ,讓這些細胞得以生存，并保持生讓這些細胞得以生存，并保持生長，分裂（繁殖），有規律的衰長，分裂（繁殖），有規律的衰老，死亡等生命活動現象老，死亡等生命活動現象（1 1）離體的動物細胞能否正常的生活、表現）離體的動物細胞能否正常的生活、表現出正常的生命活動？出正常的生命活動？只要條件適合就能表現出正常的生命活

2、動，如只要條件適合就能表現出正常的生命活動，如細胞的分裂、生長等細胞的分裂、生長等（2 2）是不是所有的動物細胞都能在離體的情）是不是所有的動物細胞都能在離體的情況下表現出生命活動？況下表現出生命活動？不是，越是幼嫩的細胞越容易培養并表現出正不是，越是幼嫩的細胞越容易培養并表現出正常的生命活動，因此在細胞培養時一般選擇幼常的生命活動，因此在細胞培養時一般選擇幼嫩的細胞嫩的細胞（3 3）細胞離體培養時，表現出什么樣的生）細胞離體培養時，表現出什么樣的生命活動？命活動？生長、分裂（繁殖）至接觸抑制生長、分裂（繁殖）至接觸抑制（4 4）離體的動物組織能否像離體的動物細胞）離體的動物組織能否像離體的動

3、物細胞一樣表現出體外培養的特征？一樣表現出體外培養的特征？動物組織在離體的情況下，也能培養并表現動物組織在離體的情況下，也能培養并表現出正常的生命活動；但與細胞培養也有不同出正常的生命活動；但與細胞培養也有不同的地方：在得到離體的組織后，需要機械處的地方：在得到離體的組織后，需要機械處理或胰蛋白酶處理得到分散的細胞再進行細理或胰蛋白酶處理得到分散的細胞再進行細胞培養，同時動物組織培養過程中可以伴隨胞培養，同時動物組織培養過程中可以伴隨組織分化。組織分化。動物組織培養，長期進行，一般都只有動物組織培養，長期進行，一般都只有單一類型細胞保存、增殖，因此成了細單一類型細胞保存、增殖，因此成了細胞培養

4、。胞培養。動物組織培養和細胞培養可統稱為動物組織培養和細胞培養可統稱為組組織織培養培養 動物細胞培養動物細胞培養過程過程 胚胎或幼齡動物的組織器官胚胎或幼齡動物的組織器官細胞懸液細胞懸液10代細胞代細胞50細胞細胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養原代培養用用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散細胞，說明細胞細胞，說明細胞間的物質主要是間的物質主要是蛋白質蛋白質。動物細。動物細胞培養適宜的胞培養適宜的PHPH為為7.27.47.27.4，此，此環境下胃蛋白酶環境下胃蛋白酶（2.02.0）沒有活）沒有活性，而胰蛋白酶性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)(7.2-8.4)的活的活性較高。性較高。比老比老齡動齡動

5、物的組織物的組織細胞增殖細胞增殖能力強，能力強，有絲有絲分裂分裂旺盛旺盛。分分化程度化程度越越低，低，繁殖繁殖能力越強，能力越強，越越容易培容易培養。養。動物細胞培養動物細胞培養不能最終培養不能最終培養成生物體成生物體細胞增殖細胞增殖緩慢，核緩慢，核型可能變型可能變化化動物組織細胞間隙中含有一定動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。和韌性的組織和器官。貼壁生長接觸抑制10代以內，保持正常二倍體核型代以內，保持正常二倍體核型傳代培養傳代培養 細胞貼壁：細胞貼壁： 懸液中分散的細胞很快就

6、貼附在瓶壁懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。上，稱為細胞貼壁。 要求：培養瓶或培養皿的內表面光滑、無要求：培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。毒、易于貼附。 細胞的接觸抑制細胞的接觸抑制： 當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。細胞的接觸抑制。 動物細胞生長特性：動物細胞生長特性：1 1、無菌、無毒、無菌、無毒 （消毒、滅菌（消毒、滅菌 ；定期更換培養液，清除代謝；定期更換培養液，清除代謝廢物廢物 ）2 2、營養、營養 （合成培養基：（合成培養基：葡萄糖

7、、氨基酸、無機鹽、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等維生素和動物血清等） 3 3、溫度和、溫度和pH pH （36.536.50.50.5，PH7.2-7.4 PH7.2-7.4 ）4 4、氣體環境氣體環境 O O2 2和和COCO2 2（95%95%空氣和空氣和5% CO5% CO2 2 ）動物細胞培養的條件動物細胞培養的條件: :動物機體組織動物機體組織單個細胞單個細胞原代培養原代培養胰蛋白胰蛋白酶酶 機械消化機械消化傳代培養傳代培養培養過程：培養過程：原代培養原代培養細胞株或細胞系細胞株或細胞系 原代培養：原代培養：從機體取出后立即進行的細胞、組從機體取出后立即進行的細胞、組織培

8、養織培養 ( (一般繁殖到一定代數后停止生長，一般繁殖到一定代數后停止生長，需要重新更換培養基）需要重新更換培養基） 傳代培養：傳代培養：將原代細胞從培養瓶中取出，配制將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。瓶中繼續培養，稱為傳代培養。相關概念細胞系和細胞株細胞系和細胞株細胞系：細胞系：可連續傳代是細胞可連續傳代是細胞細胞系種類：細胞系種類：1 1、連續連續細胞系：原代培養物在細胞系：原代培養物在首次首次傳代時就成傳代時就成為細胞系，能為細胞系，能連續培養連續培養下去的細胞系下去的細胞系2 2、有

9、限有限細胞系：原代培養物在細胞系：原代培養物在首次首次傳代時就成傳代時就成為細胞系，為細胞系，不能連續培養不能連續培養下去的細胞系下去的細胞系原因：發生轉化，大多數具有異倍體核型原因：發生轉化，大多數具有異倍體核型如：惡性細胞系（具有異體致瘤性）如：惡性細胞系（具有異體致瘤性） 獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌）獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌）細胞株：細胞株：通過一定的選擇或純化方法，從通過一定的選擇或純化方法，從原原代培養物代培養物或或細胞系細胞系中獲得的具有中獲得的具有特殊性質特殊性質的的細胞群，細胞群，在培養過程中其特征始終保持在培養過程中其特征始終保持細胞株的特點：具有恒定的細胞株的

10、特點：具有恒定的染色體組型染色體組型、同功酶類型同功酶類型、病毒敏感性病毒敏感性和和生化特性生化特性等等細胞株的種類：細胞株的種類：1 1、連續細胞株：、連續細胞株：可連續多次傳代可連續多次傳代2 2、有限細胞株：、有限細胞株：可連續次數有限可連續次數有限細胞系泛指可傳代的細胞，細胞株是具細胞系泛指可傳代的細胞，細胞株是具有特殊性質的細胞系有特殊性質的細胞系培養過程：培養過程：動物胚胎或幼齡動動物胚胎或幼齡動物的組織、器官物的組織、器官細胞懸浮液細胞懸浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代細胞代細胞原代培養原代培養50代細胞代細胞傳代培養傳代培養細胞株細胞株無限傳代無限傳代細胞系細胞系單個細胞單個細胞加培

11、養液加培養液遺傳物質遺傳物質未改變未改變遺傳物質遺傳物質已改變已改變（分解彈性纖維）（分解彈性纖維）動物細胞培養不能動物細胞培養不能最終培養成生物體最終培養成生物體動物組織培養技術的發展動物組織培養技術的發展真正開始真正開始18851885年雞神經板在生理鹽水中培養成活組織培養一詞誕生年雞神經板在生理鹽水中培養成活組織培養一詞誕生19031903年年 皮膚及白細胞培養與腹水和血清中，結果細胞的成皮膚及白細胞培養與腹水和血清中，結果細胞的成活期達活期達1 1個月，并且看到細胞分裂個月，并且看到細胞分裂19071907美國科學家將一部分蛙胚神經管培養在蛙淋巴液中，美國科學家將一部分蛙胚神經管培養在

12、蛙淋巴液中，成功看到了神經纖維末端的阿米巴運動，解決了神經纖維成功看到了神經纖維末端的阿米巴運動，解決了神經纖維起源問題，并創立了起源問題，并創立了懸浮培養法懸浮培養法萌芽萌芽19511951通過對黑人婦女的宮頸癌組織的體外連續培養，獲得通過對黑人婦女的宮頸癌組織的體外連續培養，獲得腫瘤細胞系即不死細胞系腫瘤細胞系即不死細胞系- -海拉細胞系海拉細胞系19121912年雞胚細胞的培養年雞胚細胞的培養19431943科學家在致癌物科學家在致癌物20-20-甲基膽蒽甲基膽蒽的要倒下培養小鼠結締組織，獲得了能在小鼠體內生長的要倒下培養小鼠結締組織，獲得了能在小鼠體內生長肉瘤的肉瘤的L-L-細胞系細胞

13、系組織培養工作進入了組織培養工作進入了全新階段全新階段具具 體應用體應用得得到到動動 物物 組組 織織 培培 養養應應用用胚胎或幼齡動物的臟器胚胎或幼齡動物的臟器單單 個個 細細 胞胞機械消化、胰蛋白酶消化機械消化、胰蛋白酶消化原原 代代 培養培養培養液培養液葡萄糖、氨基酸、無機鹽、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等維生素、動物血清等傳代培養傳代培養大量的組大量的組織細胞織細胞(構成組構成組織或器官織或器官)修復受損皮修復受損皮膚、器官等膚、器官等細胞株或細胞系細胞株或細胞系動動 物物 組組 織織 培培 養養應應用用胚胎或幼齡動物的臟器胚胎或幼齡動物的臟器單單 個個 細細 胞胞機械消化

14、、胰蛋白酶消化機械消化、胰蛋白酶消化原原 代代 培養培養培養液培養液葡萄糖、氨基酸、無機鹽、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等維生素、動物血清等傳代培養傳代培養藥物藥物研究治療癌癥的藥物研究治療癌癥的藥物及其療效及其療效某物質某物質檢測有毒物質、檢測有毒物質、致癌物質等致癌物質等細胞株或細胞系細胞株或細胞系獲得細胞獲得細胞細胞的全能性細胞的全能性細胞株、細胞系細胞株、細胞系植物體植物體培養結果培養結果或細胞分泌產物或細胞分泌產物快速繁殖、培育快速繁殖、培育無病毒植株等無病毒植株等培養目的培養目的葡萄糖、葡萄糖、動物血清動物血清蔗糖、植物蔗糖、植物生長生長調節劑調節劑培養基特有成分培養基

15、特有成分液體培養基液體培養基固體培養基固體培養基培養基性質培養基性質細胞增殖細胞增殖原理原理動物細胞培養動物細胞培養植物組織培養植物組織培養比較項目比較項目植物細胞和動物細胞培養的比較植物細胞和動物細胞培養的比較克隆培養法（細胞克隆）克隆培養法（細胞克隆）把一個把一個單細胞單細胞從群體中分離出來單獨培養，從群體中分離出來單獨培養，使之繁衍成一個使之繁衍成一個細胞群體細胞群體的技術。的技術。異質性細胞系異質性細胞系 克隆培養克隆培養 純系（克隆）純系（克隆） 產物:遺傳性狀均一、表現的性狀相似遺傳性狀均一、表現的性狀相似細胞克隆的細胞克隆的最基本要求最基本要求：克隆來源于：克隆來源于單個單個細胞

16、細胞細胞克隆的最主要用途之一：細胞克隆的最主要用途之一：分離缺乏特殊基因的突變細胞系分離缺乏特殊基因的突變細胞系克隆對象的選擇克隆對象的選擇依據：選擇對培養環境具有較大適應范圍和依據：選擇對培養環境具有較大適應范圍和具有較強獨立生存能力的細胞具有較強獨立生存能力的細胞 單細胞不如群體細胞單細胞不如群體細胞 原代培養細胞和有限細胞系不如無限細胞原代培養細胞和有限細胞系不如無限細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞提高細胞克隆形成率的措施：提高細胞克隆形成率的措施：選擇適宜的培養基、添加血清（胎牛血清選擇適宜的培養基、添加血清（胎牛血清最好）、以滋養細胞（如經射線照射本身失去最好）、

17、以滋養細胞（如經射線照射本身失去增殖力的小鼠成纖維細胞）支持生長、激素增殖力的小鼠成纖維細胞）支持生長、激素（胰島素）刺激、使用（胰島素）刺激、使用CO2CO2培養箱調節培養箱調節pHpH。原原代培養細胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層代培養細胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層底物）等。底物）等。動物的克隆繁殖動物的克隆繁殖分化的動物細胞也能像植物細胞一樣，實現克隆繁殖嗎？分化的動物細胞也能像植物細胞一樣，實現克隆繁殖嗎？動物胚胎發育過程（兩棲類動物胚胎發育過程（兩棲類) )囊胚囊胚桑椹胚桑椹胚受精卵受精卵二分二分裂球裂球八分八分裂球裂球原腸胚原腸胚組織、器官分組織、器官分化、形成個體化、形成個體

18、四分四分裂球裂球動物細胞全能性的表現程度動物細胞全能性的表現程度全能性大小比較：全能性大小比較： （全能性依次遞減）（全能性依次遞減）受精卵受精卵 全能細胞全能細胞 多能細胞多能細胞 單能細胞單能細胞 高度高度分化的體細胞分化的體細胞1、動物細胞的全能性隨動物細胞分化、動物細胞的全能性隨動物細胞分化程度的提高而逐漸受到抑制程度的提高而逐漸受到抑制2 2、動物細胞的細胞核仍具有全能性、動物細胞的細胞核仍具有全能性（細胞核內含有該物種全部的遺傳物質）（細胞核內含有該物種全部的遺傳物質）3、低等動物細胞的全能性一般比較容易、低等動物細胞的全能性一般比較容易體現。如：體現。如：水螅的消化細胞不經過細胞

19、水螅的消化細胞不經過細胞分裂即可轉變為上皮、肌肉細胞。分裂即可轉變為上皮、肌肉細胞。4 4、癌細胞仍能逆轉為正常細胞。、癌細胞仍能逆轉為正常細胞。 無論是分化還是癌變，變化的都無論是分化還是癌變，變化的都是表現型，基因組成的完整性并沒是表現型，基因組成的完整性并沒有改變。有改變。動物難以克隆的原因動物難以克隆的原因動物的體細胞已發生分化，動物的體細胞已發生分化， 一類基因是維持生存的；另一類基因隨一類基因是維持生存的；另一類基因隨著組織器官和發育階段不同而選擇性表達。著組織器官和發育階段不同而選擇性表達。 基因表達的調控使得細胞中合成了專一基因表達的調控使得細胞中合成了專一的蛋白質。的蛋白質。

20、分析：動物細胞難以實現克隆，那么分析：動物細胞難以實現克隆，那么如何才能實現動物的克隆？如何才能實現動物的克隆？1.1.分化程度低的細胞比較容易實現克隆，如：分化程度低的細胞比較容易實現克隆，如：胚胎細胞胚胎細胞2.2.細胞核具有全能性（必須提供促進核基因細胞核具有全能性（必須提供促進核基因表達全能性的條件，還要保證細胞的完整性）表達全能性的條件，還要保證細胞的完整性）去核的卵細胞：體積相對大，易操作；去核的卵細胞：體積相對大，易操作；含有促使細胞核表達全能性的物質和營含有促使細胞核表達全能性的物質和營養條件養條件去核的卵細胞去核的卵細胞乳腺細胞核乳腺細胞核 重組細胞重組細胞細胞核移植實驗和動

21、物的克隆繁殖細胞核移植實驗和動物的克隆繁殖核移植：利用一個細胞的細胞核（供體核移植：利用一個細胞的細胞核（供體核）來取代另一細胞中的細胞核，形成核）來取代另一細胞中的細胞核，形成一個重建的一個重建的“合子合子”核移植實驗核移植實驗19521952年，豹蛙囊胚細胞核移植實驗年，豹蛙囊胚細胞核移植實驗19781978年，黑斑蛙成體紅細胞核移植實驗年，黑斑蛙成體紅細胞核移植實驗19811981年，小鼠卵移核實驗年，小鼠卵移核實驗19971997年，克隆羊多莉的誕生年，克隆羊多莉的誕生胚胎克隆胚胎克隆 使用的核供體細胞如果來使用的核供體細胞如果來自多細胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆自多細胞階段的胚胎，叫做胚胎克隆體細胞克隆體細胞克隆 使用的核供體細胞來自使用的核供體細胞來自動物體細胞，叫做體細胞克隆動物體細胞，叫做體細胞克隆實踐證明：胚胎細胞核的移植成功率遠高于成體細胞。實踐證明：胚胎細胞核的移植成功率遠高于成體細胞。卵細胞卵細胞母綿羊母綿羊母綿羊母綿羊乳腺細胞乳腺細胞細胞質細胞質細胞核細胞核細胞核移植細胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂3 3次次C C母綿羊子宮母綿羊子宮胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育過程多莉羊的培育過程融合后的卵細胞融合后的卵細胞動物組培動物組培體細胞克隆羊的培育成功，證明了：體細胞克隆羊的培育成功，證