1、亞硝基胍誘發大鼠胃腺癌發生發展過程 中p53、ras基因表達和突變的研究New Page 1【摘要】目的探討 p53、ras 基因在亞硝基胍（N-methyl- N nitro -N-nitrosoguanidine，MNNG 誘發大鼠胃腺癌發生發展過程中的作用。方法 用免疫組織化學、 聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析 （PCR- SSCP技術對大鼠正常腺胃粘膜、癌前病變和胃腺癌組織中p53, ras 基因的表達和突變進行檢測。結果 p53 蛋白在癌組織中的陽性表達率為 50%（20/40 只），正常和癌前病變組織中為陰性；ras 蛋白（p21）癌前病變組織中陽性率為 44%（23/52只），

2、在癌組織中為 23%（9/40 只）。癌組織中 p53 基因突變率為 45%（18/40 只） ，非癌組織為陰性。癌組織及癌前病變組織中均未發現ras 基因突變。結論 在 MNN 誘發大鼠胃腺癌發生發展過程中，ras 基因的激活是一早 期事件，可能參與了癌的發生過程，而 p53 突變則主要與胃癌的進展有關。Expressi on and mutati on of p53 and H-ras genes in the carc inogen esisand developme nt of gastric ade nocancinoma in duced by MNNG in rats Meng

3、Zhenha ng, Lei Dao nian, Wang Jia ng, et al. Departme nt of Pathology, Beijing MedicalUni versity, Beijing 100083.【Abstract 】 Objective To investigate the effect of p53 and H-ras genes inthe carci nogen esis of and developme nt of gastric cancer induced by N-methyl- N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)

4、 inWistar rats. Methods The expressi on of p53 and H-ras genes in no rmal mucosa,preca ncerous lesi ons and in duced-ca ncers were studied immun ohistochemically.DNA isolated from the preca ncerous lesi on and tumors were an alysized byPCR-SSCP for exon 5-8 of p53 gene and exon 1 and 2 of H-ras gene

5、. Results p53protein were detected in 50% (20/40) of the gastric can cers studied, but not in thepreca ncerous lesio n, while p21 ras protein see n in 23% (9/40) of the gastric can cersand 44% (23/52) of the preca ncerous lesi ons. p53 gene mutati ons were detected in45% (18/40) of the can cers and

6、none in the precancerous lesions by PCR-SSCP.H-ras gene mutation was not found in either the can cers or the preca ncerous lesi ons.Con clusi ons The activati on of ras gene is an early eve nt and may be invo Ived in thecarc inogen esis of gastric can cer in duced by MNNG. In activat on of p53 gene

7、mayin flue nee the developme nt of the can cer.【Key words 】 An imal test ing alter natives Stomach n eoplasmsGenes,p53 Genes, ras大量研究顯示，細胞癌變及惡性腫瘤的形成是多因素、多階段、多基 因變異所致的結果。癌變過程的每一個階段都存在癌基因和抗癌基因一系列變 化1，2。p53基因是迄今發現的與人類腫瘤相關性最高的一種抑癌基因3，4, p53基因的缺失和突變可引起細胞惡性增殖，導致腫瘤的發生。p53 基因通常與異常激活的癌基因協同作用5。許多研究也表明， ras 基因

8、的激活與多種人類腫瘤 的發生密切相關6。亞硝酰胺類化合物是與人類胃癌發生密切相關的致癌劑， 我們利用其代表物亞硝基胍(MNNG 誘發大鼠胃腺癌和癌前病變模型，并對p53基因、 H-ras 基因在不同病變組織中的表達和突變進行了研究，旨在探討p53、H-ras 基因在胃癌發生發展過程中的作用。材料與方法1. 實驗性胃癌模型： Wistar 雄性大鼠 90 只(北京醫科大學實驗動物中 心提供)。4 周齡，體重 4555g,分為模型組 80 只，對照組 10 只，分籠常規 飼養。模型組動物飼水中加入 MNN，終濃度為 8X104卩 g/L,連續用藥 9 個 月，停藥后繼續常規飼養至 12 個月。對照

9、組動物飲用自來水。實驗滿 12 個月 時乙醚麻醉下處死動物，將胃沿大彎側切開，在胃竇部沿小彎側及腫瘤部位取 材，用于石蠟切片，另取 0.51.0g 新鮮組織提取 DNA。2. 免疫組化染色：用 ABC 法, p53 抗體(CM-5)由英國 Dundee 大學 Davie教授贈送，H-ras(259)單抗購于 Santa Cruza 公司，ABC 試劑盒購于 Vector 公司。用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染。結果判斷：組織中至 少有一群粘膜(腺)上皮細胞胞漿(p21ras)或胞核(p53)有明顯的 DAB 染色(棕黃 色)者判斷為陽性。實驗以正常大鼠胃粘膜組織作陰性對照，以已知陽性胃

10、癌標 本作陽性對照。3.PCR 反應：用蛋白酶 K-酚-氯仿方法提取癌前病變、 胃癌組織 DNA 正常對照用正常大鼠胃粘膜組織。 用 PCFT增 p53 基因第 5、6、7、8 外顯子及 H-ras 基因第 1、2 外顯子，引物序列及有關資料見附表。PCR 反應體系為 25卩 l，含模板 DNA 15(250 ng，上下游引物各 50 pmol，Taq DNA 聚合酶 1U。 反應條件：94C變性 2 分鐘，然后 94C45 秒，退火溫度和時間見附表，72C30 秒，35個循環后 72C延伸 5 分鐘，反應完成后，取 5 卩 l PCR 產物 1.5%瓊 脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。附表 p53

11、、H-ras 基因 PCRT 增引物序列基因 外顯引物序列(53)產物長度退火溫度C)時間(s)p535ACT CAA TTT CCC TCA ATA AG180 BP4650CAC CAT CAG AGC AAC GCT CA6TAT TCT TGC TCT TAG GCC TG235 bp5540GAG TCT TCC AGC GTG ATG AT7CCG GGT AGT GGG AAT CTTCTG G 206 bp5840AAG GGG TGA CTT TGG GGTCAA8GAG GTG AGC AGG CAG GAC152 bp5040AAG GGT GAA ATA TTC TCC

12、ATC GH-ras1TGA TTC TCA TTG GCA GGT GG152 bp5035GAG CTC ACC TCT ATA GTG G2CCC GAA ACA GGT AGT CATTGA T 152 bp5035GGT CAC CTG TAC TGA TGGATG T4.SSCP 分析：取 5 卩 l PCR 產物與等量加樣緩沖液（95%去離子甲酰 胺，20 mmol/L EDTA, 0.05%溴酚藍，0.05%二甲苯青藍）混合，沸水中煮 10 分 鐘變性后迅速放入冰浴中，上樣于 8%聚丙烯酰胺凝膠（29 : 1），在 1XTBE 中電 泳，4C,50 V，12 小時。電泳結束后將

13、凝膠置于含 30%L 醇和 10%酸的溶液 中平緩搖動 10小時（固定），然后 30%乙醇漂洗 2 次，每次 10 分鐘，再用三蒸 漂洗 3 次，每次10 分鐘。0.1% AgNO 溶液染色 30 分鐘，三蒸水快洗，2.5% NaCQ0.02%甲醛中顯影至條帶清晰，用 1 聽酸終止顯色反應 5 分鐘。玻璃紙 封膠自然風干，可長期保存。結果1. p53 基因、ras 基因蛋白表達的免疫組化結果：胃癌組織中p53 蛋白陽性顆粒均在胞核中（1），陽性率為 50%（20/40 只）。早期癌 p53 蛋白 5 只陽 性，進展期胃癌 1 5 只陽性（包括 2 只有肝轉移者 ） 。癌前病變組織及正常對照組

14、胃粘膜未見 p53 陽性染色。p21ras 在腸化和異型增生組織中陽性率為 44%（23/52 只），胃腺癌中為 23%（9/40 只），在少數形態正常的粘膜腺頸部或底 部可見少數散在的p21 陽性細胞。p21 蛋白定位于胞漿和胞膜（2）。1 胃腺癌組織 p53 蛋白免疫組化陽性，棕黃色顆粒定位于細胞核ABC法X200 2 胃粘膜腸上皮化生組織 p21 蛋白免疫組化陽性，棕黃色顆粒定位于 細胞漿ABC 法X2002. PCR-SSCP 吉果： 與正常對照比較，存在突變的腫瘤標本呈現異常條 帶，包括單鏈條帶泳動變位、缺失或多帶。胃癌組織中 p53 突變率為 45%（18/40 只），見 3， 其

15、中第 5 外顯子 7 例， 第 6 外顯子 11 只突變， 癌前病變 組織未見突變。 PCR-SSC與免疫組化結果相比有 3 只不一致，其中 2 只免疫組 化陽性，而 PCR-SSC 陰性，1只免疫組化陰性。而 PCR-SSC 陽性。p53 基因第 7、 8 外顯子未見突變。 ras 基因第 1、 2 外顯子在癌前病變及癌組織中均未發現 突變。箭頭所指為異常泳動帶，N:正常對照組織，T:腫瘤組織 3 p53 基因 第 5 外顯子（左），第 6 外顯子（右）SSCP 吉果討論近年來人們對 p53 和 ras 基因的研究傾注了極大的熱情。研究顯示， p53基因的失活及 ras 基因的激活在人類腫瘤

16、發生發展過程中起著重要作用， 但對 MNN誘發動物實驗性胃癌過程中 p53 和 ras 基因改變研究極少。本實驗用 MNN 所誘發的大鼠胃癌均為腺癌，其發生過程也與人類胃癌相似，即多經歷由 胃粘膜腺體腸上皮化生、不典型增生到癌變的過程。進一步研究顯示，MNN 在誘發大鼠實驗性胃癌發生發展過程中引起 p53 基因突變，并可激活 H-ras 基因 使其表達升高，但不引起 H-ras 基因突變。人類野生型 p53 基因定位于染色體 17p13,突變熱點為 58 外顯子， 大鼠p53 基因定位于 11 號染色體。野生型 p53 基因表達的蛋白半衰期甚短，一 般檢測方法難以檢出，而當基因發生突變時，其表

17、達的蛋白質構型發生改變， 半衰期延長，因此免疫組化測得的 p53 蛋白為突變型蛋白7。野生型 p53 基因 在正常細胞生長分化過程中起著負調控作用。而突變的 p53 基因則失去了野生 型 p53 功能，能與激活的 ras 基因一起轉化原代細胞3。 p53 基因的缺失或突變 可引起細胞惡性增殖，導致腫瘤發生。我們的研究顯示，p53 基因突變集中在 第 5、6 外顯子，可能為 MNN致癌的特異性改變。提示檢測胃癌組織中p53 基因的突變情況對推測其病因有一定意義，可為胃癌的預防提供依據。我們研究 顯示p53 基因突變多出現在進展期胃癌，提示 p53 基因突變可能與胃癌進展有 關，與Kakeji 等

18、8的觀點一致。許多研究表明 ras 基因的激活與細胞癌變有關，很多惡性腫瘤中有 ras 基因的突變和 ras 蛋白的過量表達。我們的實驗結果表明， ras 蛋白高表達 出現在腸化和異型增生的胃粘膜組織中，而癌組織中陽性率反而降低。 PCR- SSCP 僉測在胃癌組織及癌前病變組織中均未發現突變，提示可能是MNN 通過某種不使基因突變途徑激活 H-ras 基因， H-ras 基因的高水平表達與細胞增殖 有關。在 9 只 ras 蛋白呈陽性表達的胃癌標本中有 7 只 p53 蛋白也呈陽性染 色，兩者存在相關性，顯示 p53 基因的突變和 H-ras 基因的激活在胃癌的發生 發展過程中有一定的協同作

19、用。參考文獻1 Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science, 1987, 226：235-242.2 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectaltumorigenesis. Cell, 1990, 61：79-86.3 Hinds P, Finlay C, Levine AJ. Mutation is required toactivate the p53 gene for cooperation with the ras oncogene and transformation. JVirol, 1989, 63：739-743.4 Levine AJ, Momond J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene