1、細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測一、簡介隨著研究的進展，僅僅對細胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。在單細胞水平研究細胞因子的表達能力對研究細胞因子在疾病中的作用越來越顯的重要無比。目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析( limiting dilution analysis , LDQ和單細胞PCR應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRN俵達可以識別Th1和Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而 ELISPOT及單細胞PCR#術，

2、技術性強、勞動強度大，難以進行廣泛推廣。隨著多 標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主 要對胞內細胞因子流式細胞技術作以介紹。TH1與TH2(IL 4, IL 5, IL10),但這些研究很難外推，因為 T細胞克隆與體內T細胞功能相關性還未被揭示。早期細胞因子表達與細胞功能相關性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細月因子的合成，如 TH1(IL -2, IFN- V )近來，Jung 與 Picker 采用了 monensin、PMAlF藥物預孵，用 Brefeldin(BFA) 、Monensin 阻斷了胞

3、內高爾 基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態下，T淋巴細胞產生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細胞產生的細胞因子已釋放出來，胞內細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內多 個細胞因子，并可區分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。胞內流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞

4、群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它 方法難以比擬的優點：? 快速：流式定量檢測細胞內細胞因子可在一天內完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為 1-2小時，快速簡便；? 簡便：無需組織培養，可以全血分析，無需分離PBMCs?靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統；? 高效：可以在同一個細胞內同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據細胞免疫表型區分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數相關分析；安全：減少樣本處理與生物源性污染接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環境更準確反映了體內狀況。二、所

5、需儀器1 .流式上樣管及細胞培養皿或板2 .25%CO, 37c孵箱3 .混勻振蕩器4 .離心機5 .加樣器、Tips6 .流式細胞儀三、常用的標本類型和處理方法全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDT所口 ACDt凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。自身血漿中外周血單個核細胞 （PBMCs）:使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs 24小時內分析。組織培養基中的外周血單個核細胞（PBMCs）:用Ficoll分離PBMCs將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI

6、-1640培養基中，調節細胞濃度為 2X 106細胞/ml。細胞系與T細胞克隆：調節細胞濃度2X 106細胞/mL于新鮮培養基中。冰凍全血與PBMCs使用1X紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs用PBS漂洗，并用含1%勺BSA及10%勺DMSOJ PBS重懸，70C凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上23mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。四、所需試劑1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑依據實驗需要選擇特殊表面標志CD45圈定所有淋巴細胞CD3圈定T淋巴細胞CD4圈定T輔助淋巴細胞亞群CD8圈定T抑制淋巴細胞亞群CD19/或CD20圈定B淋巴細胞CD56圈定NK淋巴細胞

7、CD14圈定單核細胞2、熒光標記的細胞因子抗體：R&M供FITC、PE和APC標記的細胞因子抗體3、溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號 WL1000用于人或者 WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333 ）溶解紅細胞4、激活劑Phorbol 12 -Myristate 13 Acetate（PMA） （Alexis ,目錄號 ALX-445-004-M001 ）A.DMS計調節濃度0.1mg/mLB 20c儲存。勿反復凍融.分裝（20C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1: 100稀釋儲存液D.PM陽濃度25ng/mL細胞懸液Ionomyci

8、n（Alexis,目錄號 ALX-450-006-M001 ）A.于乙醇中配制成濃度 0.5mg/mLB. 20C儲存C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1: 10稀釋儲存液D.細胞懸液.Ionomycin終濃度1g/mL Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma,Catalog No.S-4881）A.無菌無疊氮鈉PBS調節濃度0.5mg/mLB.4 c儲存C.細胞懸液.SEB終濃度10內/mLCD3包被在培養板中，在蛋白轉運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞CD28加速不同刺激劑（包括 SEB CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml5、阻斷劑阻斷

9、高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內 Brefeldin -A（BFA） （eBioscience ,目錄號 00-4506）A.于DMS葉調節濃度 5mg/mLB）.- 20c儲存。勿反復凍融.分裝（20 k）C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1: 10稀釋儲存液D .細胞懸液.激活最后4-5小時BFA終濃度10內/mL.注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降 Monensin （ eBioscience ,目錄號 00-4505）6、 不含谷氨酰胺的 RPMI-16407、固定劑：細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯和變性一方面使細胞因

10、子固定在細胞內，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%勺多聚甲醛PBS溶液（eBioscience ,目錄號 00-8222 ）8、 破膜劑：含1%皂玳、0.05 %疊氮化鈉的 Hanks溶液（HBBS （ eBioscience ,目錄號00-8333 ） 將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內，于相應的細胞因子結合9、其它試劑：無菌無疊氮鈉 PBS乙醇，含1%多聚甲醛的PBS 4c儲存。五、細胞培養和刺激的基本方法細胞活化的最終結果是產生細胞因子，根據檢測指標和標本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺 激時間，以獲得最佳的實驗結果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化

11、方法。表1、細胞內細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法檢測細胞因子陽性對照刺激方法人 IFN-g方法2 （4-24 小時）人 TIMP-1方法5oA TNF-方法7 （6小時）人 IL-1a方法3 （6小時）以 IL-1方法3 （24小時）人 IL-2方法2 （4-24 小時）人 IL-4方法4人 IL-5方法1人 IL-6單核細胞：方法 3 （6-12 小時）T細胞：方法6人 IL-10方法1人 IL-12方法8人 IL-15方法3人 Fractalkine/CX3CL1方法1人 IL-8/CXCL8方法3 （24小時）人 MCP-1/CCL2方法3 （24小時）人 MIP-1a/CCL3

12、方法3 （24小時）人 MIP-1b/CCL4方法3 （24小時）人 RANTES/CCL5方法1小鼠IL-2方法9小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11如、鼠IFN方法9 or方法12a小鼠TNF-方法9為防止細胞內細胞因子分泌到胞外，在培養的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉運抑制劑（如3uM monensin , 10mg/ml 的 BFA）方法1:只使用轉染細胞檢測方法 2:人的 PBMC裝用 PMA （10 ng/ml） 和 Ionomycin （1 uM） 刺激 4-24 小時.方法3:人的PBMC使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24小時.方法4

13、:人的PBMC或者純化的CD4細胞在包被人CD3抗體的培養板中，使用含有重組人的IL-2 （10 ng/ ml,目錄號202-IL-010 ）和IL-4 （10 ng/ml ,目錄號204-IL-005 ）的培養基培養兩天；細胞洗滌后在含 有重組人IL-2和IL-4的培養基中繼續培養 2天；最后收獲細胞，使用PMA (10 ng/ml)和lonomycin (1 uM)刺激6小時方法5: CD4 + T 細胞使用 PHA (10 ng/ml) 刺激4 days方法6: T 細胞使用抗 CD3的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b (Lorre, et al ., 1994, Clin I

14、mmuno Immunopath 70:1)方法 7:使用 PMA (50 ng/ml) 和 Ionomycin (500 ng/ml) 刺激(10 ng/ml) +?(10 ng/ml ,目錄號285-IF-100)刺激2小時，然后使用IFN .方法8: PBMCs細胞使用重組人IFN LPS (1 ug/ml) 刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1細胞.方法9: EL4 在包被抗小鼠 CD咖體(25 ug/ml)的培養板中，使用抗 CD28抗體(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激 6 小時方法10: CD4+T細胞

15、在包被小鼠 CD3(25 ug/ ml)抗體的培養板中，使用含有抗小鼠的 CD28(2 ug/ml)的抗 體，重組小鼠的 IL-2 (10 ng/ml ,目錄號 402-ML-020 )和 IL-4 (50 ng/ml ,目錄號 404-ML-005)的培養 基培養兩天；然后在含有重組小鼠 IL-2和IL-4的培養基中繼續培養 3天；最后收獲細胞，使用 PMA(5 ng /ml)、Ionomycin(500 ng/ml) 和 monensin 刺激 6 小時。方法11:小鼠ip巨噬細胞使用 Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時方法12:小鼠脾細胞使用 PMA (5 ng/ml

16、)和Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小時六、流式檢測細胞染色基本過程(以全血為例)1、收獲細胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按 1: 1與培養基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉運抑制劑(參照說明書)，混勻后，37C, 5%二氧化碳培養4-6小時2、阻斷Fc受體：用于消除非特異性的結合染色在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體(CD16/32),按照1ug/106細胞的用量，在染色緩沖液中4c孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進行下一步染色。對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig或者血清進行阻斷3、細胞表面染色加適當的細胞表面染色試劑20L于Falco

17、n管中，力入100L激活后的全血(細胞濃度維持在 2X 106/mL)混勻，室溫暗處孵育15分鐘；加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。(注意：PMAtt活的全血可能會溶血不完全。)離心500g 5分鐘，棄上清4、固定和破膜加固定劑，室溫暗處孵育 15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清；加破膜劑溫暗處孵育 10分鐘。(劑量參照說明書)力口 23mLPB觥液，離心500g 5分鐘，棄上清。5、細胞內染色加入熒光標記的細胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。1% PFA固定后再上機或上機加入 PBS500LL加23mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入 500pL 七、注意事項1 .標本處理：

18、避免使用絡合鈣的抗凝劑，如 ACM EDTA因為它們會限制鈣依賴性激活過程，推薦用肝 素鈉。此外LPS, 一種常見的生物試劑污染物，是強細胞激活劑，可能會混淆試驗結果。血樣在 8小時內 分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。2 .刺激激活：檢測不同的細胞因子根據情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時間，以保證最佳的檢測效果。比如，要檢測IFN- 丫則可選擇PM府H lonomycin同時刺激；如果用 CD4做表面標記，由于多數病人的 CD4 抗原會因PMA勺激活而有不同程度的下調，所以培養時間不能太長，4-6小時為宜，否則

19、 CD4下調影響分析3 .選擇合適的對照：為保證結合的真是和可靠性，至少熒光設置以下對照：未刺激對照：激活時由于 BFA的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA 激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。同型對照：使用與熒光標記抗體相同來源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗 體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。4 . Fc受體阻斷：使用試劑阻斷 Fc受體可以有效減少非特異熒光

20、染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32 （eBioscience, 目錄號14-0161-81 ）,在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32,在人可以用過量的同種無關純化lg或血清。5 .熒光素的選擇：檢測相對低表達細胞因子如IL-4時，應選用PE或APC標記；單檢測某一細胞因子時最好也選用PE或APC標記；同時檢測多種細胞因子時，弱表達的應選用 PE或APC FITC標記最好用于高表 達細胞因子如IFN- 丫八、問題與解答問題原因解決注釋無 CD69胞內染 色細胞未激活激活劑制備不當，見激活 劑制備儲存一節。PMA+Ionomycin激活4小時后 CD3+T淋巴細胞CD69陽性率 應 &g

21、t;90%使用了錯誤的抗凝劑應使用肝素鈉，不要使用淋巴細胞激活需要 Ca,絡合Ca肝素鋰，避免使用AC叫 EDTA等絡合鈣的抗凝劑。的抗凝劑會影響激活。細胞未通透在使用通透液前先使用 溶血素溶血素輔助細胞通透BFA失活或制備不當詳見BFA制備BFA于-20C儲存詳見BFA制備胞內染 色陽性 但很弱抗細胞因子抗體濃度不對按R&D推薦量使用熒光抗體正常的激活T淋巴細胞IL-4表達通常2%應使用PE或APC標記通透后細胞在胞內染色前未 洗按操作程序通透后洗細 胞再胞內染色背景染 色太高熒光單抗不純或熒光與抗體 結合不牢導致解析出的熒光 染料非特異結合使用R&D試劑使用試劑阻斷Fc受體

22、可以有效減少非特異熒光染色，詳見Fc段受體阻斷節抗體與固定后的胞內抗原親 和力低，需提高抗體濃度。使用R&D試劑并按推薦 劑量錯誤的同型對照，對照Ig濃 度過高按R&Dt薦量使用R&CE 配的同型對照試劑嚴重的 細胞損 失洗滌離心步驟丟失細胞固定通透的細胞離心500g固定后細胞密度低于活細胞，需 用高轉速離心。加樣步驟丟失細胞棄上清帶走細胞小心吸樣溶血不完全PMA+Ionomycin 激活按操作步驟用FL3做閾 值去除碎片和未溶細胞PMASHft定紅細胞膜，PMA+I激 活全血較難溶溶血未在室溫進行在室溫進行溶血Th1/Th2細胞研究方法盡管目前提出了較多的 Th1/T

23、h2細胞表面標志，但根據淋巴細胞因子譜的異同識別Th1和Th2細胞仍然是目前最有效的手段，特別是細胞內因子標記的流式細胞技術。近來由于細胞因子 ELISA試劑盒的不斷涌現，為研究Th1/Th2細胞因子譜的變化提供了準確、可靠、快速的測定方法。但研究CD4HB巴細胞細胞因子譜變化時需要將T淋巴細胞特異克隆。最近發現，在外周血白細胞中，除CD4淋巴細胞外，CD8細胞也存在Th1和Th2樣細胞因子譜的變化，甚至酸性粒細胞也具有產生多種細胞因子的能力，如酸性粒細胞可分泌IL-4、IL-5 、 IL-1 a、IL-6、IL-8 、TNFa、 TGF等。因此單純通過細胞因子譜的變化難以有效識別Th1和Th2細胞。根據T輔助