1、大腸桿菌PCR僉測方法ICS11.220B41遼DB21DB 21/ XXXXX-XXXX大腸桿菌PCR檢測方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識（征求意見稿）XXXX - XXXXT布XXXX - XX - X雙旅遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2020年4月19日刖 百本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究O本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙鳳菊，關(guān)淼，關(guān)乃鵬，李清竹，陳瑤大

2、腸桿菌PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大腸桿菌PCR僉測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大腸桿菌的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬糞便、 臟器及純培養(yǎng)物中大腸桿菌的檢測。本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(BSL-2以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改單)適用于本文件。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 302號獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī) 范3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。E.coli:大腸桿菌(Escherichia coli)DNA：脫氧核糖核酸(Diet

3、hylpyrocarbonate )bp :堿基對(base pair)PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction )dNTP：脫氧核糖核甘三磷酸( Deoxy-ribonucleoside triphosphate ) Taq酶：Ex Taq DN鐮合酶(Taq DNA polymerase)TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液(Tris acetate-EDTA buffer)4原理根據(jù)E.coli保守基因序列設(shè)計(jì)一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與 母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5儀器和器材本技術(shù)規(guī)范中需應(yīng)用下列儀器和器材：高速臺式冷凍離心機(jī)(最大離心 力12 000g以上)、冰箱、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波 爐、分析天平、1.5mL離心管和0.2mL離心管、微量移液器和吸頭等。6試劑和材料6.1 DNAzol? Reagent: DNA抽提試劑，外觀為淡綠色，于4 8 c保存。6.2 無水乙醇：-20 C預(yù)冷。6.3 75%