1、基因編輯技術CRISPR/Cas9 1987年，日本大阪大學（Osaka University） 在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶基因進行研究時，發現在這個基因編碼區域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，但一直不清楚功能。后來的研究發現，這種重復序列廣泛存在于細菌和古細菌中。 2002年才正式命名為成簇的規律間隔性短回文重復序列CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2013年之后，研究者們在science 和nature等國際著名雜志上發表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統，并且已成功在人類、小

2、鼠、斑馬魚等物種上實現精準的基因修飾。1.CRISPR/Cas系統概述 已測序的接近90%的古細菌和40%的細菌的基因組或是質粒中至少存在CRISPR 基因座。 根據Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫體統分為3中類型：型、型和型。型和型CRISPR/Cas免疫系統需要多個Cas蛋白形成復合體切割DNA雙鏈，而型CRISPR/Cas9免疫系統只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，目前型系統是被改造的最成功的人工核酸內切酶。1.CRISPR/Cas系統概述1.1CRISPR的分布與分類： CRISPR/Cas系統是很多細菌和大部分古細菌的天然免疫系統，通過對入侵的病毒和核

3、酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。1.2CRISPR系統獲得：1.CRISPR/Cas系統概述2.CRISPR/Cas系統結構2.1CRISPR/Cas 主要由兩部分組成：2.2CRISPR結構： CRISPR是一種特殊的DNA 重復序列家族，廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats)組成，重復序列的長度通常為21-48bp，重復序列之間被26-72bp間隔序列(spacer)隔開。CIRSPR通過這些間隔序列(spacer)與靶基因進行識別。2.CRISPR/Cas系統結構2.3Cas家族： Cas(CRIS

4、PR associated)存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA 引導下對靶位點進行切割。它與fokI酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。2.CRISPR/Cas系統結構u CRISPR基因座的表達（包括轉錄和轉錄后的成熟加工）u 當該噬菌體再次入侵細菌時，CRISPR簇首先轉錄為長的crRNA前體，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.u CRISPR/Cas系統活性的發揮或外源遺傳物質的干擾u crRNA結合相關的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白復合體，通過堿基互補配對精確地與目標DNA相結合，隨后Cas蛋白對目標DNA 進行斷裂和

5、降解。3.CRISPR/Cas9系統作用機制4.CRISPR/Cas9系統Type 因其簡單性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9。現在廣泛使用的CRISPR/Cas9系統來源于釀膿鏈球菌。Type II系統具有以下特點：u 在CRISPR/Cas基因座上游會表達tracrRNA;u tracrRNA會參與crRNA的加工，這個工程亦需要RNaseIII的參與；u tracrRNA會與crRNA形成二聚體指導Cas對雙鏈DNA的切割。Cas9是一種核酸內切酶,其具有：RuvC和HNH兩個內切酶活性中心Jinek等發現Cas9在細菌和試管里對雙鏈DNA具有強烈的切割能力

6、,但是這種切割能力需要的crRNA和tracrRNA介導。4.CRISPR/Cas9系統Jinek等創造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一條嵌合的RNA鏈,使其同時具有crRNA和tracrRNA的特性,隨后的切割實驗表明,這條嵌合的RNA同樣可以引導Cas9切割目標DNA。現在普遍使用的都是crRNA和全長tracrRNA 融合體,簡稱 sgRNA (single guide RNA)4.CRISPR/Cas9系統4.CRISPR/Cas9系統釀膿鏈球菌4.CRISPR/Cas9系統CRISPR Design Tool: /E-CRISPR

7、: ZiFiT: /Cas9 Design: http:/cas9 http:/ http:/crispr.cos.uni-heidelberg.de/4.CRISPR/Cas9系統gRNA 在線設計工具：4.CRISPR/Cas9系統u 基因敲除或者敲入；u 基因修復；u 基因調控；u 文庫篩選。4.CRISPR/Cas9系統CRISPR/Cas 作用：5.CRISPR/Cas9 脫靶效應u 2013年，研究者們發表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統，但CRISPR/Cas9目前仍存在一個很嚴重且無

8、法避免的問題，即潛在的脫靶效應不可消除。u CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響不大。u Cas9蛋白不具特異性沈彬，20156.降低脫靶效應Cas9切口酶通過點突變的方法，使Cas9只有單鏈切割活性，類似于切口酶Yu Hisano et al.20146.降低脫靶效應添加同源臂(homology arm,HR)Nicolas Wyvekens et al.2015FoKI-dCas96.降低脫靶效應Feng Zhang et al. 20156.降低脫靶效應CRISPR/

9、Cpf1系統Cpf1系統更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易于傳送至細胞和組織內。Cpf1以一種不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（blunt ends）。Cpf1復合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預計有助于精確插入。Cpf1切口遠離識別位點。Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System7.視頻：基因編輯CRISPR-Cas9原理 1987年，日本大阪大學（Osaka University）

10、在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶基因進行研究時，發現在這個基因編碼區域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，但一直不清楚功能。后來的研究發現，這種重復序列廣泛存在于細菌和古細菌中。 2002年才正式命名為成簇的規律間隔性短回文重復序列CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2013年之后，研究者們在science 和nature等國際著名雜志上發表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現精準的基因修飾。1.CRISPR/Cas系統概述2.2CRISPR結構： C

11、RISPR是一種特殊的DNA 重復序列家族，廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復序列(repeats)組成，重復序列的長度通常為21-48bp，重復序列之間被26-72bp間隔序列(spacer)隔開。CIRSPR通過這些間隔序列(spacer)與靶基因進行識別。2.CRISPR/Cas系統結構2.3Cas家族： Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA 引導下對靶位點進行切割。它與fokI酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。2.CRISPR/Cas系統結構4.CRISPR/Cas9系統Type 因其簡單性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9。現在廣泛使用的CRISPR/Cas9系統來源于釀膿鏈球菌。Type II系統具有