1、植物DNA勺提取分離技術(shù) 摘要：主要介紹了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外幾種常用的DN碾取方法：CTAEfe、SDSfe等，并在對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單的歸納總結(jié)與比較分析同時(shí)，并介紹 了一些新的改良方法和其他植物提取方法 關(guān)鍵詞：植物DNA提取方法研究進(jìn)展市售中藥材大多為干品，而中藥材的加工和貯藏整個(gè)過(guò)程，如日 曬、高溫烘干等都不利于DN的完整性，為達(dá)到要求目前國(guó)內(nèi)外研究 發(fā)現(xiàn)并使用的DNA提取方法有很多1-12,其中被最為廣泛應(yīng)用的DN破取方法是傳統(tǒng)的CTAE&和SDS法13。由于不同植物的材料 組分和干濕程度各異，因此對(duì)不同植物DNA的提取存在著不同的效果。目前許多學(xué)者都在致力于研究不同的植物DN碾取方法。

2、他們?cè)?探索新方法的同時(shí)，也針對(duì)不同的植物，在傳統(tǒng)的提取方法上進(jìn)行著 一些新的改良。1.十六烷基三乙基漠化鉉（CTAE法在目前眾多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最為廣泛應(yīng)用的 一種。它既可以裂解細(xì)胞，又可以有效地去除多酚類和多糖類物質(zhì)的 沉淀，因而經(jīng)常被應(yīng)用于植物的DNAI取工作中。1.1方法及原理CTAB （hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 漠化鉉） ，是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與 酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中（0.7mol/L NaCl）, CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)

3、有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出 來(lái)。1.2 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2或Mn2曲子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便 于分離。6-筑基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醍，避免褐變，使酚容易去除PVP(聚乙烯毗咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的 絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA酚的污染；同時(shí)它也能和多糖 結(jié)合，有效去除多糖。1.3適用范圍及一些改良由于CTABg取法能夠有效地

4、去除多糖及酚類物質(zhì)的沉淀，因而 適用于從含酚類及糖類物質(zhì)較高的植物材料中提取DNA經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CTAB提取法在落羽杉屬樹(shù)木、黑木相思、野生稻、野燕麥、枸杞、 花生的DNA的提取中，相比較其他提取方法來(lái)說(shuō)都是最好的提取方 法。為了縮短提取流程，提高提取質(zhì)量，研究人員在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ) 上，針對(duì)不同植物的特點(diǎn)，對(duì)一些提取步驟進(jìn)行了改進(jìn)。李先進(jìn)11在對(duì)四種藥用蕨類DN碾取的比較研究中發(fā)現(xiàn)，由于酚類物質(zhì)極其容 易被氧化，因此可以在最開(kāi)始研磨材料的時(shí)候加入4%PVP以防止研磨中細(xì)胞組織破裂后酚的氧化，從而獲得更為理想的DNA黃永蓮5首先將材料在4C放置1 2天，以便于其葉片中的多糖類物質(zhì)的降 解；然后在用C

5、TA恥理的同時(shí)加入蛋白酶K,提高提取緩沖液中6 -筑基乙醇用量，增加氯仿/異戊醇的量和使用次數(shù)，以及縮短異丙醇 沉淀DNA2.十二烷基磺酸鈉(SDS法SDS提取法與CTA瞬取法一樣，也為常用的DNAI取方法。在DNA勺提取過(guò)程中，有機(jī)溶劑的抽提效果及裂解液的裂解效果都是影 響有機(jī)物質(zhì)去除的先決條件，不同的有機(jī)溶劑和裂解液對(duì)于不同種類 的植物DN碾取作用也有所差異。所以有很多植物比較適合使用SDS提取法對(duì)其進(jìn)行DNA勺提取。2.1原理和方法CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 漠化鉉)，是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與

6、 酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸.通過(guò)有機(jī)溶劑抽 提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出 來(lái)。注：CTAB容液在低于15C時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰 冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15C。2.2緩沖液配方2.2.1 CTABI取緩沖液的經(jīng)典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞;EDT曜合Mg2或Mn2離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DN蔬分溶解，存在于液相中;CTAB解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分

7、離；6-筑基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醍，避免褐變，使酚 容易去除。2.2.2CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方：PVP（聚乙烯毗咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的 絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA酚的污染；同時(shí)它也能和多糖 結(jié)合，有效去除多糖；（2）蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS異硫氧酸服 等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離，純化； 多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl,高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提 取緩沖液中加一定量的氯苯（1/2體積），氯苯可以與多糖的羥基作用， 從而去除多糖。用PEG8000弋替乙醇沉

8、淀DNA在500 L DNA液中 加入200 v l 20%PEG8000 （含1.2 M NaCl），冰浴20min.核酸分離， 純化；（4）多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：6-筑基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP廉乙烯毗咯酮）,PEG（聚乙二醇），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA勺結(jié)合；（5）鹽離子的去除：70%勺乙醇洗滌核酸吸附， 沉淀和溶解使用合適的 吸附材料吸附核酸，其它的雜質(zhì)均被洗掉，達(dá)到純化DNA勺目的另一 種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M),用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉 淀RNA附或沉淀后應(yīng)用70%勺乙

9、醇洗滌，以除去鹽離子等若長(zhǎng)期儲(chǔ) 存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDT腐E螯合Mg2或Mn2曲子，抑 制DNasepH直為8.0，可防止DN戚生酸解。2.3適用范圍及一些改良在對(duì)老芒麥的基因組DNA#離的研究試驗(yàn)中，SDSI取法是一種 快速、簡(jiǎn)便、有效的基因組DNAJ、量提取法。另外，在一些研究中還 發(fā)現(xiàn)，SDS取法能替代操作過(guò)程較煩瑣的大量法提取基因組DNA從而給研究工作帶來(lái)便利。在毛白楊成熟葉片基因組DNAI取的研究 中李繼東7通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，SDS提取法是提取出質(zhì)量高純度高的 毛白楊成熟葉片DNA勺最佳方法，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果將PVP加到裂解 液中，可以大大減少了試驗(yàn)的操作步驟，提取效果同樣很

10、好。另外也 有研究發(fā)現(xiàn)，SDS高鹽介質(zhì)法又較常規(guī)SDS&省去了添加液氮研磨和 水浴加熱抽提等操作，可使得DNAI取試驗(yàn)的操作變得簡(jiǎn)便快速3.高鹽低pH法運(yùn)用高鹽低pH提取法對(duì)植物的DNA行提取也較為普遍，此方 法所用的試劑僅有無(wú)機(jī)鹽和異丙醇，而醋酸鉀又是常用的無(wú)機(jī)鹽試 劑。由于高鹽低pH提取法沒(méi)有反復(fù)抽提的過(guò)程，其所需要的試驗(yàn)材 料也較少，因此比較適合應(yīng)用于瀕臨滅絕的瀕危物種植物的DNA提取。郝朝運(yùn):8在對(duì)忍冬科部分植物DNAH取方法的研究中發(fā)現(xiàn), 用高鹽低pH法能有效地防止組織破碎及沉淀時(shí)的電離化作用和酚類化合物的進(jìn)一步氧化，避免了采用酚、氯仿等有毒試劑，同時(shí)低的醋酸鉀溶液也是有效的

11、蛋白質(zhì)沉淀劑。 在高鹽提取緩沖液中加入一 定量的6-筑基乙醇，則可有效去除木本植物中含量較多的酚類物質(zhì)， 從而提高提取DNA勺質(zhì)量。所以該方法尤其適合以一年生或兩年生枝 條為材料提取的植物總DNA不但純度高、產(chǎn)量大，而且所用試劑無(wú) 毒、操作簡(jiǎn)便。最重要的是，本方法所用植物材料（枝條）不受季節(jié) 限制，容易獲得和保存，具有較高的實(shí)際操作意義。4.植物DNA勺其他提取法4.1改良尿素法通過(guò)大量試驗(yàn)后，曹文波:9研究出了改良尿素法，在原尿素 法基礎(chǔ)上在裂解液中添加6 -ME、用預(yù)冷的無(wú)水乙醇取代異丙醇沉淀 核酸、采用水平離心和快速倒出用于洗滌的乙醇等操作。并從玉米和水稻葉片中提取出了高質(zhì)量的基因組DN

12、A此種方法的DNAT率高、 快速省時(shí)、可在常溫下進(jìn)行操作且成本耗用低。 所以用改良的方法能 夠獲得純度高、濃度大的基因組DNA4.2優(yōu)化的植物總DN碾取方法黃萱10改進(jìn)了Clark利用CTAE取植物基因組DNA勺方法， 在試驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)在研磨材料時(shí)加入液氮、用剪去端部的吸頭轉(zhuǎn)移 含有DNA勺溶液，并且將加入RNaseA消化RNA勺步驟改在最后進(jìn)行 等一系列改進(jìn)，以獲得高質(zhì)量的DNA郭紅媛、余茂云11對(duì)CTAB法與SDS&進(jìn)行了總結(jié)，研究出了一種適于棉花總DNA勺提取方法， 得到的DNA!足分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究的需要，效果顯著。pH5討論關(guān)于植物DNA勺提取方法雖然前人已經(jīng)做了大量的

13、研究， 也總結(jié) 出很多諸如CTAEfe、SDS法、改良尿素法、苯酚法（根據(jù)內(nèi)宮博文14等的方法加以改進(jìn)）等適用范圍不同的植物DN碾取方法。苯酚 法是DNA的提取中應(yīng)用較為廣泛的方法，其對(duì)新鮮樣品的提取效果比 較好，但飽和酚容易氧化，平衡時(shí)操作較為繁鎖。CTAB是一種陽(yáng)離子 去污劑,既能有效的裂解植物細(xì)胞壁，又能去除多糖類物質(zhì)。從本實(shí)驗(yàn) 及其他報(bào)道來(lái)看，其對(duì)于許多新鮮植物基因組DNA勺提取是較為適用 的，但對(duì)干品中藥材的DNA勺提取純度不高4。低pH值法中的提取 介質(zhì)能有效防止組織破碎及沉淀大量材料時(shí)電離化作用及酚化合物 進(jìn)一步氧化15,所得DNA純度高，產(chǎn)率高，無(wú)須進(jìn)一步純化，可直接 進(jìn)行PC

14、FT增。參考文獻(xiàn)1 Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNAisolationprocedureforsmall quantities of fresh leaf tissue J.Bull,1987,19: 11-15.Phytochem2 Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. Aplant DNAmini-preparation:version II J. Plant MolBiol Rep,1983(1):19-21.3Aras S, Duran A, Yenilmez G. Isolation of DNA forRAPDana

15、lysis from dry leaf material of some Hesperis L.Speci-mens J. Plant Mol Biol Rep, 2003,21: 461- 4614曹 暉,畢培曦,邵鵬柱,等.中藥材苦地膽的DN用旨紋鑒定J.中藥材，1996, (12): 6105黃永蓮，劉媛，黃真池.植物總DNA勺提取方法的改進(jìn)J.湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007, 28, (3): 25-30.6袁燕，王德斌，郭麗紅.對(duì)改良CTAB&對(duì)蒜頭果基因組DNA提純效果的影響的研究:J.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 17, (2): 143-146.7李繼東，梁?jiǎn)?，吳文?毛白楊成熟葉片基因組DNAI取 方法的比較研究:J.河南科學(xué)，2009, 27, (3): 285-288.8郝朝運(yùn)，劉鵬，郭衛(wèi)東.忍冬科部分植物DNAI取方法的研 究J.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(白然科學(xué)版)，2006, 2 (1): 92-98.9曹文波，鄭璐璐，謝文海.一種提取植物基因組DNA勺方法 改良尿素法:J.華中師范學(xué)學(xué)報(bào)(白然科學(xué)版)，2008, 4,(3)： 448-451.10黃萱，高麗美，張永彥.一種優(yōu)化的植物總DN僦取方法J.西北植物學(xué)報(bào)，2004, 24, (6): 1103-1106.11郭紅媛，余茂云.一種改良的棉花總DN