1、重慶大學研究生專業實驗教學實驗報告書實驗課程名稱：凝膠電泳實驗實驗指導教師：學 院：專業及類別：生物學 學 號：姓 名：實驗日期：成 績：重慶大學研究生院制一、實驗目的1.理解凝膠電泳的分類及瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗的基本原理。2.熟練瓊脂糖凝膠電泳實驗的基本操作。3.通過實驗了解凝膠電泳實驗的注意事項并在以后的實驗中盡量避免。4.利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度、濃度和分子量以及分離大小不同的DNA片段。5.了解聚丙烯酰胺凝膠電泳測定DNA和蛋白分子量大小的方法。二、實驗材料、用具及試劑1.材料：菌落PCR產物（待檢測DNA片段）；2.用具：瓊脂糖凝膠電泳：電泳儀，水平板型電泳槽，電子

2、天平，微量移液器（10µl），槍頭，三角瓶，點樣板，梳子，微波爐，凝膠成像儀； 聚丙烯酰胺凝膠電泳：垂直板電泳槽，穩壓穩流電泳儀，梳子；3.試劑：瓊脂糖，1×TAE緩沖液，載樣緩沖液（Loading buffer），goldviwe染料，DL5,000 DNA Marker (Takara)。三、實驗原理核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，具有以下優點：便于分離、便于檢測和便于回收。其工作原理相對而言比較簡單、主要用到了物理學的電荷理論。當一種分子被放置在電場當中時，它們就會以一定的速度移向適當的電極，這種電泳分子在電場作用下的遷移速

3、度，叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。也就是說，電場強度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。已知摩擦系數是分 子的大小、極性及介質粘度的函數，因此根據分子大小的不同、構成或形狀的差異，以及所帶的凈電荷的多少，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下 ，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈離子狀態從這種意義上講 ，D N A 和RNA多核苷酸鏈可叫

4、做多聚陰離子 ( Polyanions ) 。因此，當核酸分子被放置在電場中時，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖- 磷酸骨架結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因而它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型，分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA 分子遷移要快些。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度

5、。瓊脂糖凝膠分離DNA度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。3.1 凝膠電泳的分類按照分離物質來分凝膠電泳可以分為核酸凝膠電泳和蛋白質凝膠電泳；按照分離介質來分可以分為瓊脂糖凝膠電泳技術和PAGE凝膠電泳。本次實驗我們采用按介質的

6、分類方法來學習的。3.1.1瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。 瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。 蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6-9之間，離子強度0.

7、02-0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段。3.1.2聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗室中常采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。SDSPAGE是蛋白分析中最經常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結合而帶負電荷，電泳時在電場作用下，肽鏈在凝膠

8、中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時受到的阻力不同，在遷移過程中逐漸分開，其相對遷移率與分子量的對數間成線形關系。SDSPAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續系統和不連續系統。本實驗采用垂直板狀不連續系統，其基本原理如下：不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳包含了兩種以上的緩沖液成分、pH值和凝膠孔徑，而且在電泳過程中形成的電位梯度亦不均勻。由此產生的濃縮效應、電荷效應和分子篩效應。濃縮效應 樣品在電泳開始時，通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層(一般能濃縮幾百倍)，然后再被分離。當通電后，在樣品膠和濃縮膠中，解離度最大的Cl有效遷移率最大，被稱為快離子，解離度次之的蛋白質則尾隨其后，解離度最小的甘氨酸

9、離子(PI=6.0)泳動速度最慢，被稱為慢離子。由于快離子的迅速移動，在其后邊形成了低離子濃度區域，即低電導區。電導與電勢梯度成反比，因而可產生較高的電勢梯度。這種高電勢梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。因而在高電勢梯度和低電勢梯度之間形成一個迅速移動的界面，由于樣品中蛋白質的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，所以，也就聚集在這個移動的界面附近，逐漸被濃縮，在到達小孔徑的分離膠時，已形成一薄層。電荷效應 當各種離子進入pH8.9的小孔徑分離膠后，甘氨酸離子的電泳遷移率很快超過蛋白質，高電勢梯度也隨之消失，在均一電勢梯度和pH的分離膠中，由于各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷量不同，在電場

10、中所受引力亦不同，經過一定時間電泳，各種蛋白質就以一定順序排列成一條條蛋白質區帶。分子篩效應 由于分離膠的孔徑較小，分子量大小或分子形狀不同的蛋白質通 過分離膠時，所受阻滯的程度不同，因而遷移率不同而被分離。此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，受阻滯的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各種蛋白質按分子大小順序排列成相應的區帶。3.1.3 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳特點（1）因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。（2）對蛋白質吸附極微，故無拖尾現象。（3）凝膠結構均勻，孔徑較大，可用于分離酶的復合物、核酸、病毒等大分子物質。（4）

11、透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。（5）不吸收紫外光，可直接利用紫外吸收法做定量測定。（6）有熱可逆性。（7）易破碎，濃度不能太低。（8）易被細菌污染，不易保存，臨用前配置。（9）瓊脂糖支持層上的區帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。（10）與PAGE相比，分子篩作用小，區帶少。（1）PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用（2）PAGE是目前最常用的電泳方法。（3）設備簡單（4）樣品量小（1-100ug）（5）時間短（30-60min）（6）操作方便（7）分離范圍廣（多肽、蛋白、多糖等）（8）可提高靈敏度改為超微量測定(10-12-10-9)（9）可用于蛋白質分子量測定3.2 影響DNA遷

12、移速率的決定因素(1)DNA分子的大小: 雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數的常用對數近似成反比(2)瓊脂糖濃度: 濃度越低，相同核酸分子遷移越快表1 不同類型和濃度瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃 度（%）標 準(kb) 高強度(kb)低熔點(kb)0.31-500.50.7-250.80.5-150.8-100.8-1010.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-420.1-30.1-330.05-146(3)DNA的構象: 同一分子的遷移速率：超螺旋環狀線狀切口環狀 (4)凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠:溴化乙錠（EB）插入雙

13、鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加 (5)所用的電壓:低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比 3.3 常見瓊脂糖種類及性質常見瓊脂糖的種類有兩種,分別為：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖表2 不同類型瓊脂糖的性質瓊脂糖類型凝結溫度/熔化溫度/ 標準瓊脂糖35389095不同廠家生產的不同商品其凝結溫度和熔化溫度有一定差異40428590高強度瓊脂糖修飾的低熔點/ 凝點瓊脂糖34432535859563653565超低熔點8154045低黏性低熔點瓊脂糖253070388530753.4 電泳緩沖液電泳緩沖液是指在進行分子電泳時所使用的緩沖溶液，用以穩定體系酸堿度，同時電泳緩沖液的另外一個重要

14、作用是使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移。常用的電泳緩沖液有：TAE(Tris-乙酸）緩沖液 、TBE（Tris-硼酸）緩沖液 ，兩者的區別主要有以下幾點：1）TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側將發生酸性化；2）TBE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對于高分子質量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對于低分子質量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。 3.5 凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液，在電泳時具

15、有以下作用：（1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內；（2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；（3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。表3 6×凝膠載樣緩沖液類型6 ×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍40.25%二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫0.25%二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍440% (m/V)蔗糖水溶液3.6 核酸染料電泳后，核酸需經染色才能顯色出帶型，溴化乙錠（ethidium bromide, EB）是最常用

16、的核酸染色劑，靈敏度高，它可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發下，發出桔紅色熒光。 EB-DNA復合物中的EB發出的熒光，比游離的凝膠中的EB發出的熒光強度大10倍，因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型。但是EB是致癌物，對人體有害，操作時應小心保護，使用EB時的注意事項主要有：（1）EB被認為是一種強致癌物質（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時的配制、貯存及使用：EB常用水配制成10 mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5 g/ml （4）當要知道DNA片段準確大小時，凝膠應在無EB情況下電泳，電泳結束后再用EB染色。針對EB的強致癌

17、性，公司開發了很多其他比較安全的核酸染料，GoodView是目前使用量較多的一款。它與DNA發生結合并產生很強的熒光信號，靈敏度與 EB 相當，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，而單鏈DNA呈現紅色熒光。GoldView特別適合大片段（1 kb）DNA的檢測，靈敏度高。也可用于RNA的染色。但是在針對小片段的檢測效果不如EB。四、實驗步驟4.1 PCR產物的準備表4 菌落PCR反應體系按照表4的體系和程序進行PCR擴增，擴增的的結果用于凝膠電泳實驗。4.2凝膠電泳4.2.1瓊脂糖凝膠電泳膠濃度的選取：取決于待檢測DNA片段大小，如下表： 表5 凝膠濃度所對應的線性DN

18、A長度本實驗中，DNA片段大小包含在500-10000之間，所以選取1.0%的膠濃度。瓊脂糖稱取其所需取決于所用膠板大小（40ml，80ml、160ml）和濃度（常用范圍0.8%-2.0%）凝膠濃度（%）=瓊脂糖質量（g）/膠板體積（ml）本實驗中，膠板大小為40ml，凝膠濃度為1.0%，所以稱取0.4g瓊脂糖。 TAE緩沖液配制50×TAE： Tris 242g Na2EDTA 37.2g 冰醋酸 57.1ml 加水定容至1L 1×TAE：將上述液體稀釋50倍。凝膠的制備將瓊脂糖加入盛有所需體積電泳緩沖液的三角燒瓶中； 用塞子塞住三角燒瓶頸部，在微波爐中加熱至瓊脂糖融化；

19、取出待融化的凝膠冷卻至65左右加入核酸染料，至終濃度0.5µg/ml，輕輕地旋轉以充分混勻凝膠溶液；瓊脂糖溶液冷卻時，用一個合適的梳子插入凝膠托板，置于水平板上；灌入濕熱的瓊脂糖溶液進入模具至凝膠溶液完全凝結，拔出梳子，安放到電泳槽內；添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板約1mm為止，等待加樣（提前將凝膠放入到緩沖液中，有利于凝膠中的緩沖體系和外界平衡）。加樣用10µl微量移液器吸取3µl Loading buffer于PE手套上，再吸取5µl PCR產物，將其與Loading buffer混勻；然后將上述混合液加入到凝膠板的點樣孔內，加樣時要注

20、意不要弄破凝膠，以防止樣品漏出。電泳加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60-100V，樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動；當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。觀察與拍照254nm紫外燈下初步觀察； 凝膠成像系統詳細觀察、拍照。4.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 安裝夾心式垂直板電泳槽； 配膠； 制備凝膠板； 樣品的處理及加樣； 電泳； 染色與脫色； 結果處理。五、實驗結果及分析瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖電泳結果顯示：擴增出目的條帶；電泳條帶出現拖尾現象。結果分析如下：從圖1中可以看出，本次實驗跑出了條帶，但是存在很多的問題：Mark跑的效果比較差，起到

21、的指示作用相對而言也就比較差；同時PCR產物的各條帶也不亮；拖尾現象比較嚴重，紅線框標定的條帶為我們組的實驗結果，結果顯示有輕微的拖尾現象，并且條帶不太亮。針對實驗中出現的各種問題，現將原因總結如下：拖尾在目的條帶的前面，原因可能是:樣品破碎或是被降解；樣品DNA本身不純，存在RNA。拖尾在電泳條帶的后面，原因可能是:DNA樣品濃度太高，出現非特異性擴增，這種情況可以通過稀釋模板來解決；樣品DNA本身不純，蛋白雜質阻礙DNA的泳動。(3)Mark跑的條帶效果較差可能的原因有：Mark加的量較少瓊脂糖膠做的效果不是太好，核酸染料加的較少。（4）PCR產物不是太亮的問題可能是：加樣時上樣較少制膠時添加的核酸染料較少六、實驗小結6.1瓊脂糖凝膠電泳緩沖系統：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢； 高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確；長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循 環是可取的。 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度