1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上淡紫擬青霉建議書The Investigation and Analysis Report of Paecilomyces lilacinus生物化工研究院2012年04月17日淡紫擬青霉項目建議書1、 線蟲病線蟲，又稱蠕蟲，一種低等無脊椎動物。在數(shù)量和種類上居動物界第二位，僅次于昆蟲。到1990年已發(fā)現(xiàn)植物寄生線蟲207個屬，4832個種。分布很廣，多數(shù)腐生于水和土壤中，少數(shù)寄生于人、動物和植物。植物線蟲是農作物、蔬菜、果樹、林木、花卉及藥材上重要的病原生物，危害僅次于真菌，超過細菌和病毒。我國較為嚴重的植物線蟲病有根結線蟲病、大豆胞囊線蟲病、小麥粒線蟲病、甘薯莖線

2、蟲病、水稻干尖線蟲病、粟線蟲病、松材線蟲病等。其除單獨危害植株以外，還可以與真菌和細菌共同侵染植株形成復合病害。1994年，全球因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失約12，經濟損失800億美元。我國農作物種植業(yè)因線蟲病每年約損失600多億元。多年的實踐證明植物線蟲病難防難治，目前仍無特效的化學農藥，故應遵循“預防為主，綜合防治”的方針，主要方法有：利用線蟲病被動傳播為主的特點嚴格執(zhí)行檢疫措施；利用植物線蟲在不適宜的寄主上難以繁殖的特點，選用抗病、耐病品種；利用大多數(shù)植物線蟲有在土壤中的生活史的特點，用化學藥劑預處理土壤；進行汰選和種苗的熱處理；通過秋季曬土等耕作措施破壞植物線蟲存活的適宜條件，

3、以及利用生物防治等。根據(jù)已有的報道，生防中使用較多的是生防真菌，最有效的是淡紫擬青霉。2、淡紫擬青霉淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）屬半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬。已報道的有近50種，常見的有淡紫擬青霉、玫煙色擬青霉、宛氏擬青霉等。1979年首次報道淡紫擬青霉對根結線蟲的寄生作用。此后，有60多個國家進行了研究。其具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點，在控制植物線蟲病方面功效卓著。【1】其作用機理是與線蟲卵囊接觸后，在粘性基質中其菌絲包圍整個卵，菌絲末端變粗，由外源性代謝物和其幾丁質酶的作用使卵殼表層破裂，隨后其侵入并取而代之。同時也能分泌毒素對線蟲起毒殺作用。

4、3、應用與效果【2,3】對線蟲：淡紫擬青霉是根結線蟲與胞囊線蟲卵的有效寄生菌，對根結線蟲的卵寄生率達60%70%，并具有明顯的增產效果。對其他多種線蟲也都有防治效能。對昆蟲：淡紫擬青霉可寄生半翅目的荔枝蝽蟓、稻黑蝽；同翅目的葉蟬、褐飛虱；等翅目的白蟻；鞘翅目的甘薯象鼻蟲以及鱗翅目的茶蠶、燈蛾等。對植物病原菌：在玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻惡苗病上對致病菌均有拮抗作用。淡紫擬青霉次生代謝物也具有一定的生理功效：在培養(yǎng)過程中，特別是在特殊培養(yǎng)基與深層發(fā)酵中，能產生類似吲哚乙酸產物，它最顯著的生理功效是低濃度時促進植物根系與植株的生長，同時對種子的萌發(fā)與生長也有促進作用。此

5、外其還能產生多種功能酶并具有一定農藥降解效應。4、市場現(xiàn)狀4.1 生產廠家國際上最早產品出現(xiàn)在1983年，菲律賓、法國等國家也都有過產品。中國最早是在1993年申請的產品“大豆保根劑”。目前市場上該類產品眾多，作為農藥和微生物肥料的都有。但是在國家注冊的很少，農藥生產廠家有福建凱利和德強生物，微肥（臨時證）生產廠家有河南無道理、黑龍江三龍、濰坊華濱、德強生物。【4】國外在美國、歐盟均有產品，如美國產品淡紫擬青霉 菌株251（），但都沒有出口我國。【7】4.2 研發(fā)專家【5】國內有多家單位進行過較大規(guī)模的中試與生產并已制成相應的菌劑，分別是：中科院微生物所及中國農科院生防所劉杏忠：與黑龍江三龍合

6、作推出“利根生生物有機肥（大豆保根劑）”廈門大學潘滄桑：其稱福建凱立和德強生物均采用其技術。云南大學張克勤：其針對煙草開發(fā)，經過中試和試驗，最終放棄淡紫擬青霉選擇了厚孢輪枝菌，形成產品“線蟲必可”。華南熱帶作物研究院黃俊生：多位學生發(fā)表過關于淡紫擬青霉的研究論文，未見到過產品。4.3 價格由于廠家較多，價格也多樣，100億孢子/g產品（母藥）約50-100元/Kg。凱立生物6.6萬/噸（折合66元/Kg），德強生物10萬/噸（折合100元/Kg）。也有極便宜的，約1.6萬/噸，可靠性較低。【8】5. 生產工藝與引進渠道5.1生長條件【6】淡紫擬青霉8-38可以生長，15-30生長良好，最佳生長

7、和產孢溫度為25-30。完全黑暗條件下生長最佳。生長pH為2-12，最佳生長pH為6-9，產孢最佳pH為4-6。5.2 培養(yǎng)基條件淡紫擬青霉營養(yǎng)要求不高，碳水化合物、有機酸及低級醇類都可以作為其培養(yǎng)的碳源，其中以二糖為最佳；氮源可以是有機無機氮均可。它不僅能在多種常規(guī)培養(yǎng)基上生長，并能在多種自然基質如農副產品廢料、廢渣與植物葉片或植物浸提液中生長，而且可產生大量孢子，便于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產。5.3 發(fā)酵技術真菌生物農藥的生產目前主要采用液固雙相發(fā)酵技術。發(fā)酵周期液體階段5天，固體階段7天。其它詳細發(fā)酵參數(shù)見附件【6,9】固體發(fā)酵設備視種類、大小、材質等條件，價格從幾千到幾十萬不等。如采用不銹

8、鋼發(fā)酵盤最便宜，約幾萬元；發(fā)酵池造價十幾萬；固態(tài)發(fā)酵罐則需要幾十萬。【10】5.4 使用方法福建凱立，蔬菜主要采用穴施，配以苗床消毒、條施；大豆采用拌種。德強生物，蔬菜采用穴施或溝施。5.5 產業(yè)化問題主要問題：殺滅率較化學藥劑低、起效時間較慢、藥效不夠穩(wěn)定、制劑存放時間較短的問題。產業(yè)化中需要注意其生產培養(yǎng)基要求極其簡單，所以生產成本是制約其工業(yè)化的一個主要因素。5.6 產值估算及毛利率產值估算：由于發(fā)酵工藝采用雙向發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵僅作為種子使用，現(xiàn)有設備完全可以滿足此步驟要求，生產規(guī)模完全取決于固態(tài)發(fā)酵設備的建設規(guī)模。按照液體發(fā)酵規(guī)模5噸，液體菌種接種比例約16.5%計算，可供約24.3噸固

9、體發(fā)酵使用，獲得孢子粉約166Kg，得到產品約3.3噸（孢子與輔料比例1:20），實現(xiàn)產值約26.5萬。毛利率：由于固體發(fā)酵培養(yǎng)基所選的發(fā)酵原材料直接制約生產成本，而不同技術方提供的技術所選發(fā)酵原材料也差異較大，本公司能夠利用的發(fā)酵原材料價格也不同，故無法直接推算毛利率。6、引進渠道在國內較有背景和歷史的研究者有3個，廈門大學的潘滄桑，中科院的劉杏忠，云南大學的張克勤。其他還有華南熱帶作物研究院，黃俊生；福建農林大學，張紹升等。其中廈門大學潘滄桑教授較權威，經前期接觸，其表示：淡紫擬青霉項目技術成熟，最大做到5噸罐，生產成本很低。目前有農藥號的兩家公司，凱立生物私下拿的他的技術，目前做的不好；

10、德強生物是買的他的技術，但是不遵守合同，故現(xiàn)在生產效果不好。7、結論與建議a) 市場定位：淡紫擬青霉作為治療危害極大的植物線蟲病的最有效生防產品極具潛力：其綠色安全，獲得歐美等發(fā)達國家肯定，是當前利潤較高的有機農業(yè)的線蟲防治的首選產品；在非有機領域，雖不如大劑量的化學農藥起效快、殺滅率高，但是具有獨特的持效期長等特點，也受到市場肯定。且項目銷售渠道與農化產業(yè)一致，節(jié)約市場拓展成本； b) 技術引進：由于已經開發(fā)多年，固體發(fā)酵工藝簡單，技術渠道多；c) 生產技術：主要依靠發(fā)酵技術，是本公司優(yōu)勢所在，消化吸收和試生產階段成本易控制；d) 主要問題：生產后期需要固態(tài)發(fā)酵設備，該設備是淡紫擬青霉、白僵

11、菌、綠僵菌等生物防治真菌的必須設備，且設備投資低、見效快。如配套該設備，將為農化產業(yè)的產品線打開新的思路，并可充分發(fā)揮生物產業(yè)的技術和產能優(yōu)勢，為提高利潤打開突破口。根據(jù)2011年公司提出的“一體兩翼”策略，生物產業(yè)和農化產業(yè)的一體化進程仍有待加強。淡紫擬青霉項目具有明確的作用對象、合理的市場空間、持續(xù)的發(fā)展?jié)摿ΑＭ菩写水a品可以充分利用生物產業(yè)生產資源優(yōu)勢，結合農化產業(yè)銷售渠道優(yōu)勢，實現(xiàn)兩個產業(yè)的強強聯(lián)合。并一舉打開綠色農業(yè)、有機食品這個新興市場，開拓一條具有競爭力的發(fā)展之路。同時可以為農化產業(yè)增加有機農業(yè)產品，實現(xiàn)產品線的補全，有助于樹立全面、專業(yè)、綠色的農化龍頭企業(yè)形象。針對唯一的固態(tài)發(fā)酵

12、設備問題，如購置則可以以低廉的成本為農化產業(yè)開辟新的市場道路；如暫不購置，也可以作為技術儲備，為今后的綠色發(fā)展奠定基礎。附錄：【1】 淡紫擬青霉對根結線蟲的寄生作用是秘魯國際馬鈴薯研究中心的P.Jatala首先發(fā)現(xiàn)的，并在1979年首次報道。此后，有60多個國家的科學工作者對此菌進行了研究。此菌廣泛分布于世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點，特別在控制植物病原線蟲方面功效卓著。半個多世紀以來，國內外許多專家學者對此菌進行了廣泛而深入的研究，在生物學、生態(tài)學、大量培養(yǎng)、控害效能與田間應用等方面取得了一系列研究成果。淡紫擬青霉主要針對根結線蟲。根據(jù)估計，全世界每年因線蟲危害給糧食和纖維作物造

13、成的損失大約為10%。我國農作物種植業(yè)因線蟲病每年約損失600多億元。甜菜胞囊線蟲、馬鈴薯金線蟲，溫暖地區(qū)的根結線蟲等是世界上引起嚴重植物線蟲病害的主要線蟲種類之一。在我國，東北和黃淮地區(qū)的大豆胞囊線蟲、甘薯莖線蟲、粟線蟲和水稻干尖線蟲一直造成生產上的嚴重損失。【2】淡紫擬青霉的作用對象對植物病原線蟲淡紫擬青霉是南方根結線蟲與白色胞囊線蟲卵的有效寄生菌，對南方根結線蟲的卵寄生率高達60%70%。對多種線蟲都有防治效能，其寄主有根結線蟲、胞囊線蟲、金色線蟲、異皮線蟲、甚至人畜腸道蛔蟲，是防治根結線蟲最有前途的生防制劑。淡紫擬青霉菌對根結線蟲的抑制機理是淡紫擬青霉與線蟲卵囊接觸后，在粘性基質中，生

14、防菌菌絲包圍整個卵，菌絲末端變粗，由于外源性代謝物和真菌幾丁質酶的活動使卵殼表層破裂，隨后真菌侵入并取而代之。也能分泌毒素對線蟲起毒殺作用。對昆蟲據(jù)文獻資料，淡紫擬青霉可寄生半翅目的荔枝蝽蟓、稻黑蝽；同翅目的葉蟬、褐飛虱；等翅目的白蟻；鞘翅目的甘薯象鼻蟲以及鱗翅目的茶蠶、燈蛾等。對植物病原菌淡紫擬青霉36-1菌株對植物病原菌具有拮抗效能。在玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻惡苗病上試驗，淡紫擬青霉菌株活菌體液對其菌絲生長抑制率分別為80.22%、80.50%、77.71%、75.30%和61.36%；處理柑桔果面，青、綠霉擴展抑制率為65.97%。批量處理柑桔，好果率為78

15、.44%，比對照高54.44%。【3】淡紫擬青霉次生代謝物的生理功效促進植物生長在擬青霉的培養(yǎng)過程中，特別是在特殊培養(yǎng)基與深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中，該菌能產生豐富的衍生物，其一是類似吲哚乙酸產物，它最顯著的生理功效是低濃度時促進植物根系與植株的生長，因此在植物根系施菌不僅能明顯抑制線蟲侵染，而且能促進植株營養(yǎng)器官的生長，同時對種子的萌發(fā)與生長也有促進作用。產生多種功能酶此菌能產生豐富的幾丁質酶，幾丁質酶對幾丁質有降解作用，它能促進線蟲卵的孵化，提高擬青霉菌對線蟲的寄生率，此外還能產生細胞裂解酶、葡聚糖酶與絲蛋白酶，Galvez-Mariscal研究表明：在高效菌株中蛋白酶和葡聚糖酶、淀粉酶活性高出1

16、.24.2倍和20120倍，這些酶促進細胞分裂。降解效應Somaseknar研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉能促進難溶磷酸鹽的溶解，實驗室研究證實：擬青霉菌的增溶效果達到30%，其它線蟲拮抗菌達到20%40%。同類研究還表明，擬青霉還能促進許多化學聚合物（如農藥，制革廢水等）的分解，這證明淡紫擬青霉具有一定的環(huán)保效應。防效 Lara et al.用淡紫擬青霉防治番茄根結線蟲病的結果表明，淡紫擬青霉可以寄生根結線蟲的卵，減少根結線蟲的蟲口密度和作物的根結數(shù)量，同時增加作物的產量。Benjamin Dube用淡紫擬青霉和穿刺巴氏桿菌(Pasteuria penetrans)混合施用來防治冬碗豆南方根結線蟲(M

17、. incognito)，與對照相比，產量顯著增加。Zaki et al.通過盆栽試驗確定田間施用淡紫擬青霉防治番茄根結線蟲病害的最適劑量，結果顯示，每kg土壤中混合4g菌劑較為適宜，處理的根結指數(shù)和2齡幼蟲數(shù)量分別下降了69%和86%，根結線蟲的卵囊有58%被侵染，66%的卵遭到破壞。我國，吳家琴等通過盆栽和大田試驗證明淡紫擬青霉對紅麻根結線蟲病有明顯控制作用。施用淡紫擬青霉制劑后，可顯著減輕紅麻根結線蟲病害，增產達11.9%。李芳等利用淡紫擬青霉防治煙草根結線蟲病試驗及結果表明：該菌能有效地抑制煙草根結線蟲的發(fā)生并促進植物的生長，病情指數(shù)下降43.6%，植株鮮重增加96.3%。劉杏忠等研制

18、的淡紫擬青霉菌劑在我國東北、黃淮等地區(qū)地進行了大面積防治大豆胞囊線蟲試驗，防效一般在60%以上，增產效果明顯。【4】農業(yè)部農藥注冊產品生產廠家登記證號總含量劑型有效起始有效截止福建凱立生物制品有限公司PD200億活孢子/克母藥2009.09.212014.09.21福建凱立生物制品有限公司PD2億活孢子/克粉劑2009.09.212014.09.21德強生物股份有限公司PD100億孢子/克母藥2011.09.152016.09.15德強生物股份有限公司PD5億活孢子/克顆粒劑2011.09.082016.09.08序號企業(yè)名稱產品通用名產品商品名產品形態(tài)技術指標（有效成分及含量）適用作物登記證

19、號1河南無道理生物技術股份有限公司生物有機肥無道理生物有機肥料粉劑有效活菌數(shù)0.20億/g有機質30.0%芹菜微生物肥（2010）臨字（1066）號2黑龍江農墾三龍生物科技有限公司生物有機肥利根生生物有機肥顆粒有效活菌數(shù)0.20億/g有機質25.0%大豆微生物肥（2010）臨字（1119）號3濰坊市華濱生物科技有限公司微生物菌劑DB微生物菌劑粉劑有效活菌數(shù)2.0億/g番茄微生物肥（2010）臨字（1237）號4德強生物股份有限公司微生物菌劑微生物菌劑液體有效活菌數(shù)2.0億/mL煙草番茄微生物肥（2011）臨字（1465）號濰坊市華濱生物科技有限公司引進世界微生物尖端技術，以淡紫擬青霉為主18億

20、/g（菌種歷史為：日本東京大學應用微生物研究所，中國科學院菌種保藏中心編號為：CGMCC3.829），枯草芽孢桿菌和側孢芽孢桿菌2億/g，配以中藥提取物，經特殊培養(yǎng)基和發(fā)酵技術，于2009年底推出“克線靈淡紫擬青霉”產品。主要功效為防治線蟲和促進植物生長。經過一年多的田間使用，收到了很好的效果。【5】專家介紹劉杏忠劉杏忠研制成以食線蟲真菌淡紫擬青霉為主，添加有機質等多種組分的生防菌劑-大豆保根菌劑，在我國東北及黃淮海地區(qū)推廣示范累積達35萬畝，對大豆胞囊線蟲病防效達60%-70%。2011年9月8日，由我院農畜產品綜合利用研究所三龍生物科技有限公司生產的大豆孢囊線蟲生防菌劑-利根生生物有機肥（

21、大豆保根菌劑）應用技術現(xiàn)場交流會在黑河市遜克縣召開。會議由黑龍江省土肥站主辦，黑河市遜克縣農業(yè)技術推廣中心和哈爾濱彤洲農資經銷處協(xié)辦，黑龍江省農墾科學院農畜產品綜合利用研究所、植保所、黑龍江農墾三龍生物科技有限公司做為技術依托單位和生產廠家參加了會議。潘滄桑潘教授表示“殺線1號”技術成熟，最大做到5噸罐，生產成本很低。菌株為淡紫擬青霉。目前有藥號的兩家公司，凱立生物制品有限公司（福建）也通過特殊渠道拿的他的技術，目前做的不好，老板去了美國；德強生物股份有限公司（哈爾濱）是買的他的技術，但是不遵守合同，故現(xiàn)在生產效果不好。2001年2月15日德強生物股份有限公司與廈門大學成立了廈強線蟲生防研究中

22、心，完成淡紫擬青霉項目的中試、年產500噸5淡紫擬青霉顆粒劑的中試，取得了成功，很好地完成了研究內容，并在全國各地進行了藥效試驗，取得了良好效果。張克勤我國在上世紀90年代初，由云南大學微生物發(fā)酵工程重點實驗室和中科院微生物所聯(lián)合云南煙草科學研究院農業(yè)研究所開始了煙草根結線蟲生物防治的研究工作，經過十多年的努力，從菌株篩選、劑型研制、生產技術、大田應用及土壤生態(tài)等方面進行大量研究。篩選出以厚孢輪枝菌（Pochonia chlamydospora）和淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）為生產菌株的生防菌劑兩種，經過80000余畝的大田應用，最終厚孢輪枝菌效果較為突出，形成線

23、蟲必克產品，該產品的成分是厚壁輪枝菌，生產廠家是云南陸良酶制劑有限責任公司。【6】生產技術生長條件溫度、光照和pH是影響生長發(fā)育的重要因子。淡紫擬青霉生長溫度范圍很寬，從8到38都可以生長，在1530生長良好，最佳生長和產孢溫度為2530，6和40時停止生長，35時停止產孢。由于該菌是土壤習居菌，光照對其生長和產孢有一定的抑制作用，所以在完全黑暗條件下生長最佳，其次是黑暗和光亮交替，在光亮中也能生長。pH在212均能生長，菌絲生長最佳pH為6-9，產孢最佳pH為4-6，這樣的廣譜適宜溫度和pH范圍使其在農業(yè)土壤中成為有競爭力的生物。培養(yǎng)基條件淡紫擬青霉營養(yǎng)要求不高，碳水化合物、有機酸及低級醇類

24、都可以作為其培養(yǎng)的碳源，其中以二糖為最佳；氮源可以是有機氮，也可以是NaNO3，NH4NO3等無機氮化合物。它不僅能在多種常規(guī)培養(yǎng)基上生長，并能在多種自然基質如農副產品廢料、廢渣與植物葉片或植物浸提液中生長，而且可以產生大量孢子，這就便于對其進行大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產，可以制成固體或液體菌劑，用于根施、拌種或噴施。雖然淡紫擬青霉等食線蟲菌物均可以在麥粒、大米、小米、馬鈴薯、綠豆及各種農副產品如玉米渣、鼓皮，甚至樹葉等基質上培養(yǎng)，這方面的報道很多，但是為了能使生產出的菌劑有市場前景，各研究者都在努力嘗試用價格低廉的物質來培養(yǎng)食線蟲菌物，在選材方面都盡可能的利用當?shù)匾撰@得的材料，比較有代表性的如Br

25、and et al. ( 2004 )利用當?shù)刎S富的咖啡豆殼、木薯根渣、脫脂豆、甘蔗渣作載體來培養(yǎng)淡紫擬青霉。發(fā)酵技術真菌生物農藥的生產目前主要采用液固雙相發(fā)酵技術。這一技術體系中，液相發(fā)酵水平相對較高，固相發(fā)酵基質包括了大米、麥粒等谷物及稻殼、谷糠、麥鼓等副產物甚至某些植物廢棄物如樹葉、種子及鋸末、菜園土、塘泥土等。但是傳統(tǒng)的固相發(fā)酵常存在發(fā)酵周期長、產孢率低等缺點。因此，建立新型的固相發(fā)酵技術是真菌農藥孢子生產的關鍵技術之一。在淡紫擬青霉的液體發(fā)酵方面，夏振遠等(2002)研究了淡紫擬青霉IPC菌株的最適培養(yǎng)基復合配方，探明了該菌株的液體深層發(fā)酵條件。李芳等(2005)研究表明搖床轉速不僅

26、影響淡紫擬青霉菌絲生長與孢子生成，而且影響淡紫擬青霉次生代謝物的毒力。孫漫紅和劉杏忠(2004)應用多級液體發(fā)酵，液生孢子含量已達5×l08mL-1以上，菌絲干重在1.8%以上。雙相發(fā)酵流程質量標準淡紫擬青霉PL89可濕性粉劑的質量標準福建農林大學，張紹升的專利2010.3轉讓給了漳州三炬生物科技有限公司，但是沒有農藥登記。 孢子原粉及可濕性粉劑的含孢量 孢子原粉的含孢子量120億個·g-1，合格 可濕性粉劑的含孢子量20億個·g-1，合格 孢子萌發(fā)率 孢子原粉萌發(fā)率95.0%，合格 可濕性粉劑萌發(fā)率90.0%，合格 干燥減量的要求 孢子原粉的干燥減量(質量分數(shù))12.0%，合格 可濕性粉劑的干燥減量(質量分數(shù)) 5.0%，合格 潤濕時間 可濕性粉劑的潤濕時間12.0 min，合格 懸浮率 可濕性粉劑的懸浮率(質量分數(shù)) 70%，合格 真菌雜菌率 孢子原粉在10-8、10-7和10-6三個稀釋度內不得檢出，可濕性粉劑在稀釋度10-6不得檢出。 細度 通過74 m篩質量分數(shù)96.0%，合格 毒力測定 暫無另外文獻中提到淡紫擬青霉的毒性淡紫擬青霉制劑對哺乳動物、鳥類、魚類和家蠶低毒。雌雄大鼠經口LD50>10000 mg/kg；雌雄大鼠涂皮處理LD50