1、復習題：培養基的成分包括哪幾類？各有何作用？在培養基成分中什么決定著外植體發育方向？抗生素的作用是什么？配制MS培養基時，瓊脂和蔗糖的加入量一般為多少？ 第一節第一節 外植體的選擇外植體的選擇 第二節第二節 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 第三節第三節 污染原因和預防措施污染原因和預防措施 第三章 外植體的選擇和滅菌第一節第一節 外植體的選擇外植體的選擇 1 外植體部位外植體部位2 取材季節取材季節3 器官的生理狀態和發育年齡器官的生理狀態和發育年齡4 選取適宜的大小選取適宜的大小1 外植體部位 植物體的各個部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細胞、花瓣、根、葉、

2、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。 不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導條件反應不一致的。 大多數植物來說，莖尖是較好的部位，其形態已基本建成，生長速度快，遺傳性穩定，是獲得無病毒苗的重要途徑。外植體選擇的原則 培養材料的來源是否保證是否會引起不良變異。 葉片的來源最有保證，許多植物的組織培養以葉片為外植體。 對一些培養較困難的植物，可以通過子葉或下胚軸來建立其組織培養再生體系。2 2 取材季節取材季節 p在生長開始的季節取材，若在在生長開始的季節取材，若在生長末期或已進入休生長末期或已進入休眠眠時取樣，則外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應。時取樣，則外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應。3 器官的生

3、理狀態和發育年齡 植物上部器官的生長時間雖短，其生理年齡卻較老，更接近發育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，則生理年齡越小。 下部組織越易形成營養器官，上部組織易形成花器官。 通常年幼組織比年老組織有較高的形態發生能力，容易培養，有較大的再生能力。4 選取適宜的大小選取適宜的大小 n 材料太大易污染；材料太小，難于成活。材料太大易污染；材料太小，難于成活。n 0.5cm-1.0cm。n 如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小第三章 外植體的選擇和滅菌 第一節 外植體的選擇 第二節 外植體的滅菌方法 第三節 污染原因和預防措施 1 外植體的滅菌方法

4、外植體的滅菌方法預處理：預處理：先對植物組織修整，去掉不需要的部分，流水先對植物組織修整，去掉不需要的部分，流水中沖洗干凈。中沖洗干凈。預處理的植物材料的滅菌預處理的植物材料的滅菌： 原則：原則：充分滅菌，但不傷外植體充分滅菌，但不傷外植體不同的外植體，滅菌的要求也不一樣不同的外植體，滅菌的要求也不一樣2 常用滅菌藥劑的使用和效果常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑使用濃度使用濃度（%）清除的難易清除的難易消毒時間消毒時間（min）效效 果果次氯酸鈉次氯酸鈉10-30易易530很好很好次氯酸鈣次氯酸鈣2易易530很好很好漂漂 白白 粉粉飽和濃度飽和濃度易易530很好很好氯氯 化化 汞汞0.01

5、1較難較難210最好最好酒酒 精精7075易易0.22好好過氧化氫過氧化氫1012最易最易515好好溴溴 水水12易易210很好很好硝硝 酸酸 銀銀1較難較難530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L中中3060較好較好常規的表面滅菌處理方法常規的表面滅菌處理方法把材料放進把材料放進70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）中浸泡）中浸泡5-10min。 或用或用10%的漂白粉上清液中浸的漂白粉上清液中浸10min 15min。無菌蒸餾水沖洗無菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。

6、在滅菌劑里滴入數滴在滅菌劑里滴入數滴0.1%的的Tween20（吐溫）（吐溫） 或或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。濕潤劑，則滅菌效果更好。 1）表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和）表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。處理時間，以減少組織的死亡。2）與消毒劑接觸過的切面在轉移到無菌基質前需將其切除，因為）與消毒劑接觸過的切面在轉移到無菌基質前需將其切除，因為消毒劑會阻礙植物細胞對基質中營養物質的吸收。消毒劑會阻礙植物細胞對基質中營養物質的吸收。3）若外植體污染嚴重則應先用流水漂洗）若外植體污染嚴重則應先用流水漂洗1小時以上

7、或先種子培養得小時以上或先種子培養得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養。到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養。4）HgCl2效果最好，但對實驗材料的危害最大，要用水沖洗至少效果最好，但對實驗材料的危害最大，要用水沖洗至少5次。次。 消毒注意事項消毒注意事項第三章 外植體的選擇和滅菌 第一節 外植體的選擇 第二節 外植體的滅菌方法 第三節 污染原因和預防措施 第三節污染原因和預防措施第三節污染原因和預防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養過程中培養基和培養材料滋生是指在組織培養過程中培養基和培養材料滋生雜菌，導致培養失敗的現象。雜菌，導致培養失敗的現象。1.1 污染的原

8、因： 從病源菌方面：主要有細菌及真菌兩大類； 從污染的途徑： 外植體帶菌 培養基 器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規程等引起的。1.2 細菌污染的特點細菌污染的特點：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后菌斑呈粘液狀物，而且在接種后12天即可發現。天即可發現。原因：原因：材料帶菌材料帶菌 培養基滅菌不徹底培養基滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規程操作人員未遵守操作規程因此因此接種人員的手應經常用接種人員的手應經常用70%酒精精擦凈，鑷酒精精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。1.3 真菌污染的特點真菌污染的特點：污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后污染部分長有

9、不同顏色的霉菌，在接種后310天才能天才能發現。發現。原因原因：周圍環境不清潔：周圍環境不清潔 超凈工作臺的過濾裝置失效超凈工作臺的過濾裝置失效 培養用器皿的口徑過大等培養用器皿的口徑過大等為了減少損失，提高工作效率，必須在為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環節注每個操作環節注意防止污染的發生。意防止污染的發生。 污染后的措施 發現污染的材料應及時處理，否則將導致培養室環境污染。 對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進行更嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培養基中重新培養。 要處理的污染培養瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。2 污染的防治措施2.1 防止材料帶菌

10、的措施2.2 外植體的滅菌2.3 玻璃器皿的滅菌2.4 金屬器械的滅菌2.5 布質制品的滅菌2.6 無菌操作室的滅菌2.7 操作 2.2.1 防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對 枝條先進行預培養。枝條先進行預培養。p 枝條插入無糖的營養液或自來水，以枝條插入無糖的營養液或自來水，以新抽嫩枝條新抽嫩枝條作為外作為外植體；植體；p 或或暗培養暗培養，待，待 抽出徒長的黃化枝條時采枝接種。抽出徒長的黃化枝條時采枝接種。 （2）選擇合適的時間去田間采取外植體 避免陰雨天去田間采取外植體。 在晴天采取外植體時，下午

11、采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經過日曬后可殺死部分細菌或真菌。 但目前對材料內部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。 在菌類長入組織內部時，不要去年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內部的分生組織，可以收到一定的防污染效果。2.2 外植體的滅菌外植體的滅菌（1）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌。p除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；少污染；p消毒處理消毒處理p次日再次消毒次日再次消毒p對層積過的種子也可用多次滅菌法對層積過的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都，在種子吸脹前后都要滅菌，要

12、滅菌，（2）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：2.3 玻璃器皿的滅菌 濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達25min30min。 干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌。 煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進行滅菌。2.4 金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。 這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。 干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內，放在烘箱中滅菌。 濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質品，放入高壓鍋中，用1.1公斤/厘

13、米2 （即15磅/英寸2），121 的溫度，滅菌20 min30min。2.5 布質制品的滅菌 2.6 無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%的新潔爾敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。 使用前用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。 一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。2.7 2.7 操作人員在接種時一定要嚴格操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行按照無菌操作的程序進行防止操作帶來的污染 A、整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正正 確確 錯錯 誤誤B、接種過程中盡可能達到懸空要求防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤 C、接種時不得

14、用手接觸瓶蓋內壁或瓶口防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤小結：常用的滅菌方法小結：常用的滅菌方法物理方法物理方法化學方法化學方法干熱滅菌干熱滅菌(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)濕熱滅菌濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮常壓或高壓蒸煮)射線處理射線處理(紫外線、超聲波、微波紫外線、超聲波、微波) 過濾除菌過濾除菌大量無菌水沖洗大量無菌水沖洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福爾馬林福爾馬林)過氧化氫過氧化氫高錳酸鉀高錳酸鉀來蘇兒來蘇兒漂白粉漂白粉次氯酸鈉次氯酸鈉酒精酒精 不耐熱的物質的過濾滅(除)菌 一些生長調節劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌-細菌過濾器方法。 防細菌濾膜網孔的直徑為0.22-0.45m以下，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。小 結第一節 外植體的選擇 ：優良種