1、一目的要求：一目的要求： 學習和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質的學習和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質的原理與方法。原理與方法。實驗八實驗八 凝膠過濾法分離蛋白質凝膠過濾法分離蛋白質二原理二原理分子篩層析分子篩層析molecular-sieve chromatography凝膠過濾層析凝膠過濾層析gel-filtration chromatography分子排阻層析分子排阻層析molecular exclusion chromatographyn凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當混合溶液過凝而大分子物質卻被排除在外部。當混合

2、溶液過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質按不同分子量篩膠過濾層析柱時，溶液中的物質按不同分子量篩分開。分開。凝膠過濾介質凝膠過濾介質n不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好的分子篩功能，不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好的分子篩功能，多孔的網狀結構。多孔的網狀結構。n常用凝膠：常用凝膠： 葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠）和瓊脂糖凝膠（Sepharose），聚丙烯酰胺凝膠（），聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel P）。）。n凝膠因交聯度不同凝膠因交聯度不同,孔徑不同，交聯度越大，孔徑越小。孔徑不同，交聯度越大，孔徑越小。n蛋白質分子直徑蛋白質分子直徑 凝膠孔徑時，被排阻在外，小于孔凝

3、膠孔徑時，被排阻在外，小于孔徑者則進入凝膠。徑者則進入凝膠。交聯葡聚糖凝膠（交聯葡聚糖凝膠（Sephadex）n葡聚糖和葡聚糖和3-氯氯-1，2環氧丙烷以醚鍵相互交聯形成。環氧丙烷以醚鍵相互交聯形成。n按交聯度大小分按交聯度大小分8種型號，種型號，G值代表不同交聯度。值代表不同交聯度。n Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200n數字表示每克干膠膨脹時吸水量的數字表示每克干膠膨脹時吸水量的10倍。倍。 Sephadex G-25代表每克干膠膨脹時可以吸水代表每克干膠膨脹時可以吸水2.5克。克。蠕動泵蠕動泵記錄儀記錄儀部分收集器部分收集器梯度制造儀梯度制造儀層析

4、層析柱柱檢測儀檢測儀洗脫洗脫液液G值越小，交聯度越大，網孔越小，吸水膨脹越小，只能值越小，交聯度越大，網孔越小，吸水膨脹越小，只能分離相對分子量小的物質；分離相對分子量小的物質； G值越大，交聯度越小，網孔越大，吸水膨脹越大，可以值越大，交聯度越小，網孔越大，吸水膨脹越大，可以分離相對分子量大的物質；分離相對分子量大的物質；n分離范圍分離范圍Mr（肽和球蛋白）（肽和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000 Sephadex G 50 1500-30000Sephadex G 75 3000-70000 凝膠過濾層析特點凝膠過濾層析特點n設備簡單，操作方便設備簡單，操作方便n分離條

5、件溫和，樣品回收率高分離條件溫和，樣品回收率高（100%）n實驗重復性好實驗重復性好除鹽除鹽n選擇孔徑小，交聯度大的凝膠。選擇孔徑小，交聯度大的凝膠。nSephadex G-25 全排出的最小分子量為全排出的最小分子量為5000 nSephadex G 50 全排出的最小分子量為全排出的最小分子量為30000 （除鹽的蛋白質分子量必須大于（除鹽的蛋白質分子量必須大于30000，消除凝膠對蛋白質的，消除凝膠對蛋白質的滯留作用。）滯留作用。）n當分子量未知時，選擇當分子量未知時，選擇Sephadex G-25 n洗脫時，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大洗脫時，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而

6、最后流出，結果使大小不同的物質分離。用葡而最后流出，結果使大小不同的物質分離。用葡萄糖凝膠萄糖凝膠G-25或或G-50過柱的辦法除鹽，所用的過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。時間就比較短。n 用于分離及測定樣品分子量：標準分子量樣品，用于分離及測定樣品分子量：標準分子量樣品，logMW對洗脫體積作圖對洗脫體積作圖三、器材與試劑三、器材與試劑n120cm層析柱、自動部分收集器，蠕動泵層析柱、自動部分收集器，蠕動泵n葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠Sephadex-50n蒸餾水蒸餾水n 三角鐵架三角鐵架n 4mg/ml 藍色葡聚糖溶液藍色葡聚糖溶液(200萬）萬）n6mg/ml細胞色素細胞色素C溶液溶液 （

7、幾萬）（幾萬） 樣品混合液樣品混合液n2mg/ml重鉻酸鉀溶液（幾百）重鉻酸鉀溶液（幾百）四、實驗操作四、實驗操作1、凝膠溶脹、凝膠溶脹n取取Sephadex G-50 15g，加，加500ml蒸餾水室溫溶脹蒸餾水室溫溶脹一天（或沸水浴中溶脹一天（或沸水浴中溶脹1h）。）。n待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細顆粒，然后待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細顆粒，然后再放些蒸餾水攪亂，靜置使凝膠下沉，再傾去上層再放些蒸餾水攪亂，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無細顆粒為止。清液，至無細顆粒為止。 n不能劇烈攪拌，嚴禁用磁力攪拌器，否則易破碎，不能劇烈攪拌，嚴禁用磁力攪拌器，否則易破碎，使流速下降和

8、分離效果降低。使流速下降和分離效果降低。實驗操作實驗操作2、裝柱、裝柱u取取120cm層析柱，底部出口套上乳膠塑料管，向層析柱內層析柱，底部出口套上乳膠塑料管，向層析柱內加蒸餾水加蒸餾水(趕走層析柱下過濾層死體積和接口處的氣泡趕走層析柱下過濾層死體積和接口處的氣泡)，在，在蒸餾水高度約占層析柱高蒸餾水高度約占層析柱高1/3時，關閉下端出口（用橡皮筋）。時，關閉下端出口（用橡皮筋）。u自頂部緩緩加入自頂部緩緩加入Sephadex-50懸液，待底部凝膠沉積懸液，待底部凝膠沉積1-2cm時，打開下端出口，凝膠加至離層析柱頂部約時，打開下端出口，凝膠加至離層析柱頂部約3cm。u用蒸餾水過柱幾遍，以穩定

9、床體積用蒸餾水過柱幾遍，以穩定床體積(不能讓凝膠表面露出水不能讓凝膠表面露出水面面)。u裝柱時，凝膠柱內若有氣泡或分離斷層，可用玻棒攪動消除裝柱時，凝膠柱內若有氣泡或分離斷層，可用玻棒攪動消除或重新裝柱，裝柱結束后凝膠表面應平整。或重新裝柱，裝柱結束后凝膠表面應平整。n3、加樣：、加樣：n取取4mg/ml 藍色葡聚糖溶液、藍色葡聚糖溶液、6mg/ml細胞色素細胞色素C溶液、溶液、2mg/ml重鉻酸鉀溶液各重鉻酸鉀溶液各6滴混合滴混合-上柱樣品。上柱樣品。n打開下端出口，使表面的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平打開下端出口，使表面的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平（不可使床面干掉），關閉下端出口，用

10、滴管將上述樣品緩（不可使床面干掉），關閉下端出口，用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面緩地加到床表面( 不要使平整的床表面攪動不要使平整的床表面攪動)。n打開下端出口，讓樣品進入床內，直至樣品全部進凝膠柱，打開下端出口，讓樣品進入床內，直至樣品全部進凝膠柱，關閉下端出口。關閉下端出口。n滴加蒸餾水使凝膠柱上端有滴加蒸餾水使凝膠柱上端有2cm水柱水柱 。實驗操作實驗操作4、洗脫和收集、洗脫和收集 n打開下端出口，讓柱內液體緩慢流出，調節蠕動泵打開下端出口，讓柱內液體緩慢流出，調節蠕動泵流速，流速流速，流速0.33ml/min (3分鐘分鐘1ml，不能讓凝膠不能讓凝膠表面露出水面表面露出水面)。n設置

11、部分收集器參數，每設置部分收集器參數，每3分鐘收集分鐘收集1管。管。n取小試管取小試管20支，每管收集支，每管收集1ml，觀察三種顏色出現，觀察三種顏色出現的管號，用的管號，用+，-或或5，4，3，2，1，0數字表示顏數字表示顏色深淺。色深淺。實驗操作實驗操作5、繪制洗脫曲線。、繪制洗脫曲線。n實驗操作實驗操作543210凝膠再生和保存凝膠再生和保存nSephadex，Sepharose-多糖，微生物多糖，微生物-酶酶-水解糖苷鍵水解糖苷鍵n各種凝膠懸浮液加防腐劑或滅菌各種凝膠懸浮液加防腐劑或滅菌-冰箱（冰冰箱（冰點以上）保存數月點以上）保存數月n防腐劑：防腐劑：0.02%疊氮化鈉疊氮化鈉n高

12、壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：0.1MPa，30分鐘分鐘長期保存長期保存n凝膠凝膠-低濃度酸或堿溶液短期浸泡低濃度酸或堿溶液短期浸泡-水水反復洗滌去雜反復洗滌去雜-過濾抽干過濾抽干-50%乙醇乙醇-70%-90%-95%乙醇逐步脫水，乙醇逐步脫水，60 80 C烘干烘干-裝瓶保存裝瓶保存n注意：溶脹凝膠不能直接高溫烘烤注意：溶脹凝膠不能直接高溫烘烤n 交聯度越小，越難以脫水，可以將其較交聯度越小，越難以脫水，可以將其較長時間浸泡在長時間浸泡在60-70%乙醇中脫水乙醇中脫水五、注意事項五、注意事項n接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液漏液n裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，流速不宜過快，避免壓裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導致層析過程中，緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導致層析過程中，凝膠床