1、武漢輕工大學畢業設計（論文）論 文 題 目：UPLC法測定黃芩提取物中黃芩苷和黃芩素的含量Determination of BaicaLin and BaicaLein inScuteLLarein by UPLC method2015年6月武漢輕工大學學士論文目 錄摘 要1Abstract2第一章 緒論31. 黃芩的研究進展31.1黃芩的藥理作用31.2 黃芩的有效成分41.3黃芩的檢測方法42. 研究內容73. 研究意義73.1禽類73.2 豬83.3 反芻動物8第二章 實驗研究101. 材料方法101.1 實驗材料101.2 實驗方法102方法學驗證122.1 系統適應性122.2 標準

2、曲線及線性關系考察132.3精密度試驗142.4穩定性試驗152.5重復性試驗152.6加標回收率的測定163黃芩的提取液含量測定164 討論165 試驗方法的優缺點175.1 缺點175.2 優點18參考文獻19致 謝21摘 要建立用超高效液相色譜（UPLC）同時測定黃芩中黃芩苷、黃芩素的方法。方法:將適量黃芩提取液溶于甲醇，于100mL容量瓶中定容，配成黃芩供試品溶液。檢測方法：Waters 超高效液相色譜儀，色譜柱為ACQUITY UPLC®BEH C18 (2.1×50mm ,1.7um) ，流動相為乙腈（流動相 C），0.05% 磷酸（流動 D ）；00.68mi

3、n ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min,30%C ,40%D的梯度洗脫。流速為0.61mL/min，柱溫30，紫外檢測波長為278nm，進樣量為0.02µL。結果：本方法線性范圍為：黃芩苷6.496µg/mL（r=0.999），黃芩素3.248µg/mL（r=0.9991）。 結論：本方法操作簡便、準確、線性關系良好、分析時間短，能同時檢測黃芩中兩種有效成分（黃芩苷和黃芩素），適用于各種黃芩的質量控制。關鍵詞：黃芩苷；黃芩素；超高

4、效液相色譜法；含量測定 AbstractAbstract：To estabLish a UPLC method for the simuLtaneous determination of baicaLin, baicaLein in ScuteLLaria baicaLensis. Methods：dissoLve appropriate amounts of ScuteLLarein extracting soLuton into MethanoL. thus getting the ScuteLLarein tested soLution. Determination methods:UP

5、LC anaLysis of target compounds was conducted on a Waters UPLC system with ACQUITY UPLC®BEH C18 (2.1×50mm ;1.7um).The mobiLe phase was composed of acetronitriLe (soLvent C) and 0.05% phosphoric acid (soLvent D),and the foLLowing gradient was used: 00.68min, 30% soLvent C,70% soLvent D ;0.6

6、81.02 min,30%40% soLvent C,70% 60% soLvent D ;1.022.30min, 30% soLvent C, 40% soLvent D. ALso the foLLowing rate of the foLLowing phase is 0.61mL/min. A 0.02 µL sampLe and a standard soLution were individuaLLy injected into the chromatographic system. The temperature of the coLumn was maintaine

7、d at 30 , and the eLuent was monitored at 278 nm. The quantities of the BaicaLin and BaicaLein were caLcuLated by comparing the peak areas to those of the standards . ResuLts：The Linear reLationship was in the range of 6.4 to 96 g/mL (r = 0.999) for，BaicaLin，and the range of 3.2 to 48g/mL（r=0.9991）.

8、ConcLusion：The method is simpLe, accurate, good Linearity and time saved，and can determine two effective compounds in ScuteLLarein，thus the method can be used to controL the quaLity of the sorts of pharmaceuticsKey Words ：BaicaLin; BaicaLein; UPLC; Content Determination第一章 緒論1. 黃芩的研究進展1.1黃芩的藥理作用黃芩是一

9、種多年生長草本的植物也是一種重要的傳統中藥，高度約為2060cm。生長稚嫩的黃芩在根的內部是實心的，而生長時間比較長的老根則是空心的，里面會出現一條空隙，一條主系根非常的粗壯，與圓錐的形狀差不多，最表層的的外部皮是比較暗的褐色，但是內部的顏色是黃色。當黃芩的生長到幼年時期基部的葉莖開始分支，莖葉的形狀與四棱形的形狀相似。葉子對稱生長，與披針形狀是一樣的，全緣的長度約為13厘米，葉子的表面呈現出深綠色，背面則為淡淡的綠色，非常漂亮，葉柄極短或者沒有葉柄。頂端有一個非常大的花絮，花絮偏向枝的另一端，花瓣的呈現出苞片的形狀像兩片唇形，上部分的唇冠向上突起，花冠特別大，前部的花冠紫色比較深，連接莖葉部

10、分的花瓣顏色比前面的略淡，有點偏白色。黃芩的小堅果近乎為圓形，黑色的果實，根呈圓錐形狀，銷彎曲，因生長年限長短不同，故黃芩的形狀大小不等。中年生長的黃芩的根部大約為1030cm，直徑約為14cm,藥材的頭部出現炸裂的形式，表明老根中心部位己經枯萎。像這種比較老的根，它的外表是棕黃色的殘留部分的的皮比較粗糙，就像那種溝溝壑壑的支條痕跡。質硬而脆易折斷。斷面非常不平坦。遇潮濕或者冷水會慢慢的變為綠色。沒有明顯的氣味，黃芩味苦。我們一般認為根部長，而且非常堅硬，皮的表面光滑，內部結構顏色為黃色的是最好的，這些唇形科藥用植物黃芩經人工風干黃芩藥材根有非常高的藥用價值，日常生活中處理工序比較好的的這種藥

11、材售價是非常貴的。黃芩的藥性呈現出寒涼，補肝腎，在傳統中藥里，黃芩廣泛應用于輕微發炎、癌癥、鼻出血癥狀、肝炎腹瀉不止、子宮內出血、心血管機能障礙、上呼吸道感染和胃腸感染的治療，具有去火的療效，降低人體內的毒素，還有潤燥增濕的功能，能降低膽固醇含量的水平，長期服用可以緩慢降低高血壓，治肺熱止咳嗽、治溫去熱病，還有對于肺炎、咳血、痢疾、濕熱黃膽、胎動不安等癥狀非常有效，最近的研究顯示表明黃芩具有抗腫瘤的效應， 目前研究表明黃芩在抵抗腸道有害細菌的感染，以及改善腸道菌群失調等方面有良好的作用，因此在目前人藥市場上黃芩主要作為腸道疾病藥物，治療慢性氣管炎，治療小兒急性呼吸道感染，治療傳染性肝炎，治療腎

12、炎、腎盂腎炎，治療高血壓病等疾病。1.2 黃芩的有效成分黃芩主要含五種有效成分分別為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類化合物。黃芩主要發揮藥理作用的有效成分是黃芩苷（圖1）和黃芩素（圖1）。黃芩提取物中富含類黃酮成分，例如：黃芩苷和黃芩素，由于其治療效應，包括其抗腫瘤、護肝、抗菌、抗炎、抗氧化作用，對甲型流行性感冒病毒PR3有抑制作用、溶劑對多種皮膚真菌有不同程度的抑制作用、此外，黃芩能使體內的血糖含量上升，并有利膽、明目、抑制腸管沒有必要的生理機能的運動、加強腸胃的蠕動和抗過敏的作用。一定程度上可以降低心血管疾病，類黃酮化合物已經得到了相當多醫學家的焦點關注。 在這些組分中，黃芩苷和

13、黃芩素具有廣泛的生物效應且低毒的特點，因此在制藥過程中，應改進提取工藝，以獲取更多的黃芩苷和黃芩素。黃芩素黃芩苷圖1 1.3黃芩的檢測方法取物的成分組成復雜，并且存在其他干擾成分，有關定量分析中藥生物活性成分的各種方法多見報道。我們以前研究類黃酮化合物的工作者一般用高效液相色譜、液相色譜-質聯聯用（LC-MS）超高效液相色譜（UPLC）、紫外分光光度法定性定量的分析方法來測量各種基質中類黃酮的含量。1.3.1 紫外分光光度法此種方法的條件使用一定頻率的紫外光線可見光照射黃芩苷，從而引起黃芩分子中的中價電位的電子躍遷，此方法將會有選擇地被吸收物質。隨著吸收波變化的光譜。從儀器中顯示出一個特定的試

14、樣特征，在一個不變的波長下，紫外可見的范圍內 ，以吸收的程度為X軸，以已知的為Y軸，可以發現，吸收的程度正比于成分的濃度，因此測量光譜可以進行定性分析。蔡越秀采用此法測定黃芩里面黃芩苷的含量，結果顯示表明該方法方便快捷簡單，可供黃芩苷質量控制用。1.3.2液相色譜質譜聯用（LCMS）將液相色譜的分離物質能力與質譜的定性分析功能相結合起來就是色譜質譜聯用，一定條件下可以對準確定量、定性黃芩中的黃酮類混合物。而且也省略了一系列樣品處理過程，使實驗的定性定量更方便更簡潔，液質聯用與氣質聯用互為補充，分析不同性質的黃酮類復雜的化合物。1.3.3高效液相色譜法高效液相色譜法(HPLC)能準確測高效的定性

15、定量測量復雜組分中黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量。宋衛嘗試用HPLC法成功測定出雙黃連含片中黃芩苷和漢黃芩素的含量；周靜安成功的采用HPLC測定黃芩中藥牙膏中的黃芩苷與丹皮酚的含量，均得到滿意效果。為了評估黃芩提取物的質量，發展超高效液相色譜（UPLC）分析方法，從而能夠同時測定草本提取物中多種目的成分便顯得尤為重要。中草藥植物黃芩中含有的主要的有效成分是黃芩苷和黃芩素，此外還有少量的漢黃芩苷和漢黃芩素等成分，四種黃酮類物質都有紫外吸收的特征結構大苯環，對黃芩苷和黃芩素的分析增加了干擾，因此需要尋找一種能夠同時高效地把黃芩中可能含有的多種組分分離并鑒定出來的方法。超高效液相色譜法（UPLC）能根據

16、這四種組分的極性不同將其同時分離出來，因此本實驗中采用UPLC法測定黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量。文獻中曾報道過的同時分析黃芩中幾種組分的方法有如下：溫慶偉測量小柴胡湯配方顆粒中黃芩苷的含量中應用的超高效液相色譜，色譜條件為ACQQUTY UPLC C18 (2.1mm×100mm，1.7um)色譜柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(40:60)，流速0.31mL/min,檢測波長315nm.出峰的效果非常好，而且無雜質峰的出現，黃芩苷的保留時間約為7.9min。李強為了測量黃芩藥材中黃芩苷的含量采用超高效液相色譜，色譜條件SHIMADZU 超高效液相色譜儀Shim-pack XR-O

17、DS C18柱 ( 4.6mm × 150mm，2.2m) ; 流動相: 甲醇 水 冰醋酸( 45 55 1) ,流速: 0.6mL/min ; 檢測波長: 274nm; 柱溫:45; 進樣量 3L;黃芩苷出峰的保留時間約為7min,黃芩素出峰的保留時間3.5min,效果非常顯著性。李華等人分別用HPLC和UPLC測量黃芩中五種酮類成分的含量，并比較HPLC和UPLC兩種方法的優缺點，HPLC的色譜條件 DiamonsiL C18(250mm×4.6mm,5um);流動相：流動相A為乙腈-水-甲酸（21：78：1）流動相B為乙腈-水-甲酸（80：20：1）梯度洗脫（010m

18、in.100% A;105min.100%90%A . 3570min.90%65%A;7085min,65%5%A;柱溫：30，流速：1.0mL/min;檢測波長：280nm.黃芩苷的保留時間為18min , 黃芩素的保留時間為55min,實驗進程不是太理想，檢測時間太長，耗費的原材料太多，使用UPLC時的色譜條件 Aquity BEH C18 （50mm×2.1mm ,1.7um）;流動相：0.1%甲酸水溶液A-乙腈B，梯度洗（00.5min.82%A;0.5-2.0min,82%80%A;2.06.0min 80%70%A;68min.70%A；810min 70%40% A;

19、1012min 40% A；柱溫 40 ;流速 0.4mL/min;檢測波長：280nm。黃芩苷的保留時間為3.0min,黃芩素的保留的時間6.0min。所以我們使用UPLC會使效率更高，精確度很高。劉金欣，孟繁蘊，張勝海，盧恒 ，周驍騰采用 UPLC 同時測定黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A的含量 色譜條件Waters accquity UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 m）；流動相：乙腈（B）-0.1%甲酸（A），梯度洗脫（09 min，11%19%B；910 min，19%23%B；1013 min，23%36%B；1315

20、min，36%90%B）；體積流量為0.6 mL/min；進樣量為2 L；檢測波長280 nm，黃芩苷的保留的時間為 5.0min，黃芩素的保留為10.0min,效果非常明顯。梁研嘗試用WatersC18（4.6×250 mm，5 um），以甲醇水磷酸（47:53:0.2）為流動相等梯度洗脫的方法，來測量黃芩中黃芩苷、黃芩素的含量，流速為0.61 mL/min，檢測波長為280nm，柱溫為24，得到比較好的分析效果，但是黃芩苷出峰的保留時間約為18min，黃芩素出峰的保留時間約為58min，分析時間非常長，耗費的原材料太多，所以還是不太理想。徐占飛等人綜合了其他人的高效液相色譜（HP

21、LC）的方法，在此基礎上改進了前人的研究方法，采用超高效液相色譜來測量雙黃連膠囊中黃芩苷和黃芩素的含量時采用AgiLent EcLipse XDBC18柱（4.6×250 mm，5 um），以甲醇0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，檢測波長為277nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10µL，柱溫為30，結果出乎意料，因為分析顯示黃芩苷和黃芩素的分離度非常好，每一種物質峰分離的非常明顯，黃芩苷出峰的保留時間為14min，黃芩素出峰的保留時間為24min； 李春紅采用Dikma DiamonsiL C18柱（4.6×250 mm，5 um）測量梔子金花丸中黃芩苷

22、、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量時，以乙腈0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，梯度變化為0min20min50min，乙腈5%15%45%，變波長測定，柱溫為30，流速為1.0 mL/min，進樣量為10µL，結果顯示黃芩中各組分分離度很好，特征峰明顯，黃芩苷保留時間為7min，黃芩素保留時間為16min；測量效果不錯李春改變了色譜柱采用Dikma DiamonsiL C18柱（4.6×250 mm，5 um）測量龍膽瀉肝制劑中黃芩苷和漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量時，以乙腈0.05%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，梯度變化為0min10min20min，乙腈30%40%90%

23、，檢測波長為278nm，柱溫30，流速為1.0 mL/min,進樣量為10µL，結果顯示黃芩苷的出峰保留時間為7min，黃芩素的出峰的保留時間為16min，各峰之間分離很好，而且時間縮短了綜上述考慮，最終決定采用劉金欣，孟繁蘊，張勝海，盧恒 ，用 UPLC 同時測定黃芩中黃芩苷、黃的含量時的方法，并在實踐中按照實際需求和實際結果，將方法做出改進，把洗脫梯度變化修改為，流動相：乙腈 C ，磷酸 D ；00.68min ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min

24、,30%C ,40%D的梯度洗脫，黃芩苷和黃芩素對照品溶液分析結果對比，得到的結果顯示，出峰非常快，所用時間短，效率比較高，黃芩苷和黃芩素的分離度優良且與其他各峰之間分離良好，因此在之后的研究中采用此方法。2. 研究內容本文主要通過對黃芩的質量標準及其測定方法的研究，研究一種分析黃芩中黃芩苷和黃芩素含量的高效、快速、便捷的超高效液相色譜（UPLC）方法，用于實際生產中黃芩原料藥的質量控制。3. 研究意義我國畜牧業的生產發展一直受抗生素類等藥物殘留制約，我們在不斷尋找有效的方法來控制動物體內的藥物殘留。因此，我國科研人員一直不斷努力尋找那種無殘留且高效的綠色飼料添加劑，也是他們艱苦奮斗目標。黃芩

25、苷因具有較好的抗氧化提高免疫等功能，對動物體內產生的耐藥性很小，在我國畜牧生產實踐中已得到驗證，并且應用非常廣泛。但是目前黃芩苷在畜禽生產中還主要是以復合制劑形式添加到飼料中為主或以藥物注射添加為輔。3.1禽類李振舊采用含有黃芩植物藥材喂養白羽雞蛋雞取得了非常好的效果，并且在夏天的時候，他還做了飼喂蛋雞添加黃芩植物藥，這些實驗研究表明黃芩可以明顯的提升蛋雞的白蛋白質量濃度，還可以降低血清中乳酸脫氫酶，升高堿性磷酸酶的活性。為了研究黃芩提取物是否能治療和防治蛋雞大腸桿菌、白痢，梁英選取的實驗動物為作為實驗研究材料，實驗數據表明剛剛出生的蛋雞存活率非常高，而且發病率明顯降低，并且蛋雞的器官病理變化

26、有明顯的降低趨勢，發病的治愈率都比其他的實驗組高很多，此次實驗證明了黃芩提取物可以提高蛋雞的抗病機制，一定程度上抑制了蛋雞體內的細菌。梁英等人為更好的探究黃芩提取物對雞生長性能和腸道微生物的影響，在肉仔雞飼糧中加入一定量的黃芩提取物，每天飼喂，比較肉仔雞的生長性能以及微生物的數量，經過 一段時間的喂養，每一只肉仔雞體內的大腸桿菌、沙門氏細菌菌群的數量明顯的降低，令人驚訝的是乳酸菌菌群的數量出現顯著性的增加，實驗研究表明飼糧中添加適量黃芩中草藥可以一定程度上促進肉仔雞顯著性生長，一定程度上改善畜禽生物菌群的生長速度，最后實驗結果顯示在肉仔雞的基礎日糧中添加 10mg/kg黃芩提取物，雞的生產性能

27、最明顯。3.2 豬 為了研究黃芩提取物對斷奶仔豬的生產性能的影響，李國忠等人選取了一定數量的斷奶仔豬，在斷奶仔豬的的日糧中加入一定梯度的黃芩提取物，經過一定時間的飼養，可以明顯的觀察到加入黃芩提取物的實驗組的斷奶仔豬食欲加強，斷奶仔豬的采食率明顯升高，而且斷奶仔豬的腹瀉率明顯降低，一定程度上降低了飼料的成本，提高了飼料報酬，從實驗數據來看在飼料中添加15%的黃芩提取物，斷奶仔豬的生產性能是最好的，采食量比沒有添加黃芩提取物的對照組斷奶仔豬提高了12.9%，飼料的料重比明顯的降低了15.0%。所以黃芩提取物對斷奶仔豬的生產性能有非常大的影響。 徐中進一步研究了黃芩提取物對生長豬的生產性能的影響，

28、在李國忠的實驗基礎上選取了大小相同、體重相近的日齡在45天的三元雜交的生長豬進行實驗，將實驗組的豬隨機的分為兩組，一組添加黃芩提取物，另外一組不添加黃芩提取物，結果數據顯示添加黃芩提取物的實驗生長豬的生產性能明顯提高，為了探究生長豬最適宜的黃芩提取物的濃度，徐中繼續配置了一系列梯度的濃度的黃芩提取物的飼料日糧，飼喂一段時間后發現，實驗組豬飼料中添加0.20%的黃芩提取物的生長豬平均日增重比其他實驗組的生長豬生產性能明顯提高了829，添加的飼料的料重比明顯降低了496，差異性非常顯著。3.3 反芻動物火曉東閱讀文獻發現黃芩提取物對家禽、豬的生產性能都有一定的影響，而且在一定的濃度內，是有明顯的升

29、高的趨勢，為了確定黃芩提取物對反芻動物生產性能有促進影響，研究人員設置兩個實驗組，一組添加一定量的黃芩提取物，另外一組作為空白實驗組，研究發現黃芩提取物能促進反芻動物的生產性能提高。為了探究反芻動物的最適宜的黃芩提取物的濃度，徐中繼續配置了一系列梯度的濃度的黃芩提取物的飼料日糧，飼喂一段時間后發現，意外發現黃芩提取液可以一定程度上降低應急牛奶，牛奶的奶乳與對照組沒有明顯的差異因此說明奶牛飼糧中添加含黃芩的中草藥，可以一定程度上有效的緩解熱應激對產奶奶牛的不良影響，且不會影響牛奶品質。第二章 實驗研究1. 材料方法1.1 實驗材料實驗儀器：Waters超高效液相色譜系統（二元脫氣泵，PDA檢測器

30、，1525型泵，033381型自動進樣器，MiLLennium32化學工作站）（美國Waters公司）； BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；電子分析天平（奧豪斯國際貿易有限公司）（上海）SH72000型予華牌循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）RE52型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）DHG9141A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）D2G6020真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）DF101S智能集熱式恒溫磁力攪拌器（武漢德力祥儀器設備有限公司）SH7-2000 循環抽水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)KQ5200型 超聲波清洗機（昆山市超聲波儀器有限

31、公司）1000uL移液槍 （大龍實驗儀器北京有限公司）有機針筒過濾器 Ø13mm 孔徑 0.22um (上海興亞凈化材料廠)試驗試劑：黃芩飲片（天馬中藥飲片科技公司）(安徽);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司); 黃芩素標準品 （中國食品藥品檢定所）（含量為97%）;甲醇（色譜純）（天津市科密歐化學試劑有限公司）； 乙腈（色譜純）（天津市科密歐化學試劑有限公司）；磷酸（武漢市江北化學試劑有限責任公司）1.2 實驗方法1.2.1 色譜條件色譜柱為water 公司ACQUITY UPLC®BEH C18 1.7um (2.1×50mm coLumn Made in

32、IreLand)，流動相為乙腈0.05%磷酸，流速為0.61mL/min，柱溫30，紫外檢測波長為278nm，進樣量為0.4µL。流動相用抽水式真空泵微孔過濾（乙腈用聚偏氟乙烯樹脂濾膜過濾，磷酸用無機濾膜過濾），然后置于超聲波清洗機中超聲脫氣20分鐘。表1 梯度洗脫條件序號時間(min)流速（mL/min)%C（乙腈）%D（0.05%磷酸）1初始0.61307020.680.61406031.020.61653541.360.61307052.300.6130701.2.2標準溶液配制分別精密稱取黃芩苷對照品(含量以93.3%) 0.0080g、黃芩素對照品97.8%,置于五氧化二磷

33、減壓干燥中干燥12小時以上使用) 0.0040g加適量甲醇，超聲15min后,帶其冷卻，定容至50mL的容量瓶中,配置成濃度為160ug/mL的對照品黃芩苷母液、濃度為80ug/mL的對照品黃芩素母液，待用。1.2.3黃芩苷和黃芩素原料藥溶液的提取的制備用稱取分析天平稱取14倍的藥材劑量黃芩飲片60g，用一次性塑料袋密封裝袋待用，裝入三口瓶中，加入50%的水和50%的乙醇混合液820mL ,緩慢加入三口瓶中，瓶口用塞子封住，防止乙醇揮發，浸泡30min，加入磁力攪拌轉子，加上溫度計,接上回流冷凝管，打開水龍頭，在磁力旋轉蒸發器中蒸餾175min ，溫度設置373K，取提取液5管，每管5mL置于

34、04冰箱中待用。1.2.4 黃芩苷、黃芩素樣品混合液的配置取1.2.3原料提取液1mL于100mL的容量瓶中，加適量的甲醇，超聲15min,加甲醇至刻度線,置于04的冷藏箱中待用。2方法學驗證2.1 專屬性考察精密吸取1.2.2中黃芩苷、黃芩素濃度為96µg /m L、48µg /m L的對照品溶液 、黃芩提取液混合液待用，記錄色譜圖（圖2）。由圖可知，在此UPLC方法下，黃芩提取液中的黃芩苷和黃芩素能夠達到充分分離，分離度很好，對比樣品色譜圖與標準品色譜圖，證明tR =0.6min出峰物質為黃芩苷，tR=1.2min的出峰物質黃芩素。 圖2 黃芩苷對照品 圖3 黃芩素對照

35、品 圖4 黃芩提取液樣品2.2 標準曲線及線性關系考察精密吸取1.2.2黃芩苷、黃芩素對照品溶液1、2、5、10、15mL，分別用進口甲醇定容至25mL的容量瓶中配置成黃芩苷的濃度為6.4 、12.8 、32 、64 、 96ug/mL,黃芩素的濃度為3.2、6.4、16、32、48ug/mL的對照品溶液，每次進液0.4uL,進樣6次，在上述色譜條件下，測定色譜峰面積，分別以黃芩苷、黃芩素對照品的濃度為橫坐標X，峰面積Y為縱坐標得到線性回歸方程，得到黃芩苷回歸方程 y=2220.7x-270.32，R=0.999,得到的黃芩苷線性范圍6.4ug/mL96ug/mL得到其黃芩素的回歸方程y=36

36、96.6x-279.56,R=0.9991,得到其黃芩素的線性范圍3.2ug/mL48ug/mL。圖 5 黃芩素的標準曲線圖6 黃芩苷的標準曲線2.3精密度試驗精密吸取1.2.2黃芩苷、黃芩素標準對照品溶液5mL置于25mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，用0.22um的進口過濾膜過濾，每次進樣0.4uL，進樣9次，精密吸取1.2.3.1黃芩苷、黃芩素提取液混合液5mL置于25mL的容量瓶中，定容至刻度，用0.2uL的進口過濾膜過濾，每次進樣0.4uL，進樣9次，得到黃芩苷、黃芩素標準對照品的峰面積的積分值RSD=1.30%、RSD=1.4%，說明儀器的精密度良好。 表2 精密度實驗（n=9)序號

37、黃芩苷峰面積黃芩素峰面積168187558332700785764536993857112468525570695703855678966921456656768426584638679485815596900957426均值69078.8957238.67 RSD%1.301.402.4穩定性試驗精密吸取1.2.3.1中黃芩提取液溶液0.4µL，按上述色譜條件，在配制完成后的0、1、2、4、8、16、24h內各測定一次含量，每個時間間隔內連續進樣3針，進行測定黃芩苷、黃芩素的峰的面積的測量，有下表可知黃芩苷的RSD=0.30%,黃芩素的RSD=1.20%，故黃芩苷、黃芩素的混合提取

38、液在24小時內穩定性良好。表3 穩定性實驗時間（小時）峰面積平均值降解量（%）黃芩苷黃芩素黃芩苷黃芩素012511940508001125089400590.021.122125103398740.011.614124857398430.211.648124978389990.103.7216124567395320.442.4124124148394730.802.562.5重復性試驗精密吸取1.2.3黃芩苷、黃芩素提取液混合液5mL置于25mL的容量瓶中，定容至刻度，用0.2uL的進口過濾膜過濾，每次進樣0.4uL，進樣6次，得到黃芩苷、黃芩素的提取液混合液的峰面積的積分值 RSD=0.6

39、2%、RSD=0.77%，說明本方法重復性良好。表4 重復性試驗（n=6）序號黃芩苷峰面積黃芩素峰面積127188982080227667785195327331685611427344081955527713185972627393882349均值275366.8983508.78RSD%0.791.902.6加標回收率的測定取已知含量黃芩苷、黃芩素的1.2.4提取液混合液1mL于25mL容量瓶中，按照提取液中黃芩苷的含量的 80%、100%、120%加入黃芩標準品溶液（含量為93.3%），用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。每個水平配置3個平行樣品。取已知含量黃芩苷、黃芩素的1.2.4提取

40、液混合液1mL于25mL容量瓶中，按照提取液中黃芩素的含量的 80%、100%、120%加入（含量為97.8%），用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。每個水平配置3個平行樣品。測定前需配置相同試樣濃度的黃芩苷、黃芩素試樣濃度，加標試樣濃度，加標量試樣濃度，每次進樣0.4uL,進樣三次取平均數。3黃芩的提取液含量測定 按照1.2.4的方法配制三批不同的黃芩原料藥溶液，并精密吸取樣品溶液20µL，每個樣品各進3針，進樣量為0.4uL,在上述色譜條件下進行分析，記錄色譜圖，積分求得黃芩苷和黃芩素的峰面積值，按照外標法求得各樣品中黃芩苷和黃芩素的含量。結果如下表（表4）所示。表5 不同批次黃

41、芩中黃芩苷和黃芩素的含量批次黃芩苷峰面積黃芩苷含量mg/g黃芩素峰面積黃芩素含量mg/g第一批12510356.53953210.8第二批12414856.03947310.7第三批12485756.34050811.04 討論本試驗采用 超高效液相色譜（UPLC測定黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量，經對流動相組成、比例，以及柱溫、流速、檢測波長等進行色譜條件的優化，我們先后嘗試了流動相：乙腈（B）-0.1% 磷酸（A），梯度洗脫（09 min，11%19%B；910 min，19%23%B；1013 min，23%36%B；1315min，36%90%B）；這種洗脫的效果不是太佳，而且比較浪費原料

42、，故比較好的測定樣的色譜條件為流動相；為乙腈（流動相 C），0.05% 磷酸（流動 D ）；00.68min ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min,30%C ,70%D的梯度洗脫。我們試用過320nm波長條件，紫外吸收效果不佳，最終我們確定為流速為0.61mL/min，柱溫30，紫外檢測波長為278nm，進樣量為0.4 µL。在此色譜條件下，黃芩中黃芩苷、黃芩素與雜質峰完全分離，且峰型對稱無拖尾。另外，在此條件下黃芩苷在6.496µg/mL范

43、圍內，黃芩素在3.248µg/mL范圍內線性關系良好，相關系數r=0.999和0.9998。結果表明，采用UPLC法測定黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量快速、簡便、靈敏度高，為黃芩提取物中黃芩苷和黃芩素的同時測定提供了方法。在實驗的過程由于黃芩提取物中黃芩苷、黃芩素的濃度是未知，為了更好地確定提取物的濃度我分別作了多次實驗，第一組從提取液中用移液槍吸取了1000uL的提取液，加入100mL的容量瓶，用超高效液相（UPLC）測出峰的面積。第二組的是從提取液中吸取2mL的提取液溶解在100m的容量瓶中，加甲醇稀釋，測出兩組峰的面積相差一部左右，為了使樣品的峰的面積恰好處于標準曲線的適用范圍，實

44、驗期間配制了非常高的濃度的黃芩苷、黃芩素的標準品，最后發現從黃芩提取液中吸取1mL的溶液，稀釋100倍后過濾進樣是比較合理的。由于超高效液相色譜對實驗樣品的要求非常高，所以在每次測樣的時候我們都需要進行不斷的進行過濾，有時過濾的過濾器會出現質量問題，所以每次過濾完畢的之后，我們需要檢查溶液是否過濾干凈，防止在樣品檢測的時候將柱子堵塞。我們使用的水必須是試驗中采用電阻率為18.25的超純水，且對流動相的品質要求高，并要求進行嚴格的過濾及超聲處理，否則極易導致柱壓升高，柱子堵塞，甲醇的濃度必要高。5 試驗方法的優缺點5.1 缺點1）由于原料藥的濃度是不確定的，所以在配置的提取樣的時候，濃度具有不確

45、定因素的，需要配置多個濃度梯度來選擇符合要求的濃度樣品濃度，有時會因為每批次的樣品不一樣導致提取液濃度不一樣，為了更好的進行樣品含量的檢測，我們需要進行不同批次的含量檢測。2）由于提取物的樣品成分含量比較復雜，而且儀器對樣品要求比較高，我們需要進行多次過濾，當儀器壓力偏高的時候，應立即停止測量，進行儀器的保養工作。3）未進行加樣回收率試驗。由于做加樣回收率實驗導致儀器的壓力偏高，儀器出現報警，為了防止柱子被堵，只好放棄本次的實驗操作。5.2 優點本文研究的方法，能夠快速、簡便、高效的分析黃芩中黃芩苷和黃芩素的含量，且主峰與雜質峰分離度很好，峰型對稱，無拖尾峰，基線平穩。雖然存在標準溶液濃度范圍

46、偏小的問題，但是在后續的試驗以及實際應用中仍然有很高的參考價值。1) 小顆粒、高性能微粒固定相同時出現。5um的UPLC色譜柱填充料為十八烷基硅膠鍵合柱，但是我們用的是1.7um BEH 十八烷基硅膠鍵合柱。這樣的孔徑更加利于物質分離2) 采樣速度非常快，且采用二極管陣列檢測器，可以得到3d光譜圖，更利于復雜物質分離檢測的定性判斷3) 自動進樣技術水平非常高，每次進樣之后系統都會進行洗針操作，因此可以達到低擴散減少了交叉污染。系統還配備了壓力輔助系統，可以更好的觀察到系統的壓力，針上還裝備了進樣探頭，可以精確快速的采樣。4) 儀器整體系統優化設計。色譜工作站配備了Waters公司的 E-pow

47、ers-3的系統，以及搭載了多種軟件平臺，實現了更加準確定性分析，減小系統帶來誤差。 5) 與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度都比HPLC高很多，我們使用UPLC檢測黃芩苷用了0.6min,檢測黃芩素1.2min，在同等條件下使用HPLC測量黃芩苷需要5.7min,而黃芩素素需要13.4min左右才能出峰，所以它縮短了分析時間，同時減少了流動相溶劑用量降低了分析成本。參考文獻1陳立柱、趙懷清HPLC法同時測定消炎片中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量.沈陽醫科大學學報. 2011.6.28（6）2丁瑞.HPLC法測定清解合劑中黃芩苷的含量.海峽藥學J，2013，25（2）3胡世強、張偉、張永耀 RRLC法同時測定蒲地藍消炎膠囊中綠原酸、野黃芩苷、黃芩苷混合黃芩素的含量 中藥新藥與臨床藥理 2013.24.4 （7）21何秀瓊、裴利霞、王一濤、鄭穎 高效液相色譜法研究大鼠灌胃黃芩素的藥動學 中國醫院藥學雜志 2010.30.223梁妍、石任兵、梁吉春HPLC法測定黃芩中黃酮中3種成分的含量. 北京中醫藥大學學報. 2009.32（4）4李春紅、梅志強、何兵、田吉HPLC同時測定龍膽瀉肝制劑中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量. 生物學通報.2012.47 (4)5李曉明、羅