1、FACSCalibur雙色熒光檢測簡易操作步驟BD FACSCalibur流式細胞儀簡易操作步驟1. 一、開機（見開機程序）開機1） 先打開凈化交流穩壓電源，其次打開110V穩壓輸出電源，再次打開流式細胞儀，最后打開計算機。在圖上用明顯顏色標記出減壓閥位置2） 向前拉開儲液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減壓閥（紅色箭頭所示）方向調在VENT位置（箭頭方向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調在RUN位置。二、開啟CellQuest 軟件、編輯實驗文件1） 在蘋果菜單下點擊在屏幕下方點擊CELLQuest（第四個圖標） 啟動軟件。桌面會

2、出現一Untitled 實驗文件，可點擊實驗文件的左右上角的放大鈕（紅綠色），將實驗文件窗口放大。2） 從工具板中點擊散點圖圖示。在實驗文件的空白區點擊，拖曳對角線至適當大小，然后放開鼠標。出現散點圖對話方框（當所要編輯的圖窗口被選中時，會在其四角出現四個小黑塊）。3） 在出現的散點圖對話方框中點擊Plot Source，選擇Acquisition and Analysis (收取、分析) ，確認X和Y軸參數預設為FSC-H 1024、SSC-H 1024。說明：散點圖（Dotplot），又稱二維散點圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個獨立參數的相互關系。在圖中， 橫坐標X軸橫坐標X軸為為熒

3、光1強度的相對值，單位是道數，縱坐標Y軸則通常表示熒光2或光散射強度的相對值。儀器使用者可因應實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。第一圖X和縱坐標Y軸參數分別設為FSC-H 1024、SSC-H 1024；雙熒光標記時，第二圖X和Y軸參數分別設為FL1-H 1024、FL2-H 1024，X軸為為熒光1強度的相對值，單位是道數， Y軸則通常表示熒光2或光散射強度的相對值。儀器使用者可因應實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。修改動作為輕擊圖譜上X和Y軸參數，并依需要選擇之（FSC：細胞大小，SSC：細胞折射率，FL1：FITC綠色熒光，FL2：PE橙色熒光，FL3：PerCP紅色熒光）。4）從屏

4、幕上方Plots菜單中選擇Dot Plot功能，可復制一個同樣大小的散點圖，在出現的對話方框內選擇X軸：FL1-H 1024，； 如果是雙標，Y軸選擇：FL2-H 1024(根據實驗檢測樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2來說明)，如果是單標，Y軸選擇：SSC-H。點擊OK，FL1/FL2的散點圖出現。完成后可將重制圖移至原圖右方。說明：散點圖（Dotplot），又稱二維散點圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個獨立參數的相互關系。在圖中， 橫坐標X軸和縱坐標Y軸參數分別設為FSC-H 1024、SSC-H 1024；雙熒光標記時，第二圖X和Y軸參數分別設為FL1-H 1024、FL2-H

5、 1024，X軸為為熒光1強度的相對值，單位是道數， Y軸則通常表示熒光2或光散射強度的相對值。儀器使用者可因實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。修改動作為輕擊圖譜上X和Y軸參數，并依需要選擇之（FSC：細胞大小，SSC：細胞折射率，FL1：FITC綠色熒光，FL2：PE橙色熒光，FL3：PerCP紅色熒光）。5） 在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點圖上拖動Quadrant的中心將它設定在（x，y）（101，101）處，這些象限將指定陰性/陽性區域。6）從工具板中點擊直方圖圖示，在實驗文件的空白區點擊，拖曳對角線至適當大小，然后放開鼠標。單色熒光只需一個直方圖，和第二個散點圖一樣，

6、橫坐標選擇FL-1，縱坐標默認為Counts；若是雙色熒光，需畫2個直方圖，一個橫坐標選擇FL-1-1024，另一個橫坐標選擇FL-2-1024；7）在上面直方圖中畫出M1和M2，其中M1代表隱性數目（一般標示是101），M2代表陽性數目（除M1以外所有的部分）。8）從Stats菜單中選擇Quadrant Stats（象限統計）,5）步驟中的點圖將分為四個象限。三、建立儀器和計算機之間通訊 從Acquire菜單中選擇Connect to Cytometer (快捷鍵Win+b)，此時會出現Acquisition Control 對話方框。四、儀器設置文件注意：實驗數據質量，取決于最適化儀器設定

7、文件。儀器設定文件不能在數據收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設定文件。儀器設定文件（Instrument settings），含信號器高壓（Detector/ Amps），閾值（Threshold），熒光補償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設定的順序為Detector/Amps - Threshold - Compensation。1） 檢查現有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。出現 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口確認FSC與SSC（根據實驗樣品確定，一般細胞選擇LIN，細菌

8、選擇LOG），其它FL1-3為LOG（對數放大），將其拖至空白區。2）從Cytometer菜單中選擇Threshold，出現 Threshold 窗口在Threshold 窗口：確認FSC為設閾參數，初步確認預設閾值52。將其拖至空白區。3）從Cytometer菜單中選擇Compensation，確認所有預設數值皆為零。將其拖至空白區。五、 上樣品、設置儀器使儀器處于High RUN，樣品管支撐架左移，上陰性對照管樣品，支撐架回位。確認Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不儲存數據，用于儀器設置)，點擊Acquire。 1、調節FSC/SS

9、C探測器（電壓）觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓(Voltage)預設為E00，可調節 Amp Gain 從1.009.99 使主要細胞群得以清楚顯示（如細胞較大，將FSC電壓設置于E-1；較小細胞，將FSC電壓設置于E01）。調節SSC電壓使主要細胞群得以清楚呈現。調節FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨立離散的細胞族群，該細胞群不與其它族群、細胞碎片有重迭現象。調整定位后，點擊Acquisition Control 窗口中的Pause。2、Gating 圈選細胞檢品中，常含有大小不同、性質相異的細胞群體。我們常用前方散射（FSC）與側方散射（SSC）的二維位圖，即散射光圖譜（Sca

10、tter Plot），來圈選出不同細胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細胞族群。1） 在工具板中選擇多邊形的Region，在FSC/SSC散點圖上劃定淋巴細胞R1 區域（如下圖）。分析樣品時，區域內細胞應會呈現成紅色，可移動或改變形狀來圈選有意義的細胞。如果要刪除R1區域，您可以在工具列中點選Gates Region list ，以鼠標點選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區域。刪除R1區域后，可用繪圖工具板，重畫R1。2） 選取希望Gate的FL1/FL2散點圖、FL1直方圖和FL2直方圖，從WindowsPlots菜單中選擇Show InspectorFo

11、rmat dot plot。在出現的對話方框內，將No Gate 改選 G1=R1。點擊OK。 3、調節FL1、FL2的探測器（電壓）1）點擊Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中調節FL1、FL2的電壓，使Negative Control細胞群著落在所選直方圖或散點圖之100-101處。2）在Threshold 窗口，適當地提高FSC閾值>52，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細胞族群。 3）點擊Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去陰性對照管，關閉Detector/Amps、

12、Threshold窗口，我們已設定好有意義細胞群之自體熒光，不要再改動Detector/Amps、Threshold等數值。4、調節熒光補償說明：最適化的最后一步是調節光譜重迭。（如是單色熒光實驗可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時需調節FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色樣本，必要時需調節FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補償）。1） HighLow RUN，換上單染CD3-FITC管。點擊Acquisition Control窗口中的Acquire。調節FL2-%FL1使FITC陽性細胞在FL1/FL2散點圖的右下象限。補償調節可通過點擊­

13、;¯來選擇或直接拖動滑標上下移動。調節完畢，點擊Acquisition Control窗口中的Pause。2） 移去單染CD3，換上單染CD19-PE管。點擊Acquisition Control窗口中的Restart。調節FL1-%FL2使PE+細胞在FL1/FL2散點圖的左上象限。調節完畢，點擊Acquisition Control窗口中的Pause。3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機，點擊Acquisition Control窗口中的Restart，確定三群細胞工整垂直。當您已完成2色熒光之光譜重迭時，點擊Acquisition Control窗口中的Pa

14、use、Abort。4）移去樣本管，換上ddH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態。關閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。六、收集實驗數據1）決定儲存細胞總數：預設之儲存細胞總數為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition & Storage，并在出現的窗口功，確認Collection Criteria從10000 of All，再點擊OK。 2） 找個檔案匣準備儲存數據，本機所有數據都貯存在D盤data盤中，按實驗日期編排。從Acquire 菜單中選擇Parameter Description，出現Parameter Descri

15、ption對話方框。點擊Folder，并在隨后出現之對話方框，選擇Your Folder或新建活頁夾，點擊此對話方框的Select Your Folder（一般用實驗日期來命名Folder）。3） 命名即將儲存之文件名：點擊Parameter Description對話方框的File，出現文件名編輯窗口，輸入文件名（根據實驗來決定），點擊此對話方框的OK。4） Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關參數名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。輸入參數名會存入實驗檔案中，顯示在圖譜上。5）計數器Counters：從Acquire

16、 菜單中選擇Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數進度6）開始收集實驗數據。LOW RUN（根據Counters來調節速度，一般保持在700-800/Second），將第一管樣品放到檢測區，在Acquisition Control窗口中，將 ý Setup 改成 ¨ Setup，此時CellQuest會自動顯示 Your Folder文件名為資料文件名。點擊“Acquire” 便可啟動樣品之分析測定與數據儲存。當計算機成功地收取足夠數據，會自動儲存數據文件文件名.001，并會以“嘟”聲告知，CellQuest會自動升冪附加檔名成文件名.002。等待下一指示。7）

17、換上超純水，清洗管路，直到Counters持續顯示0/Second 30s (約為10-20s)，換上下一管樣品，點擊“Acquire” 啟動樣品之分析測定與數據儲存。可繼續分析直到所有檢品都分析完畢。七、退出軟件并關機1）. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲存實驗文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。2） 檢品分析完畢后，用鼠標從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取Disconnect to Cytometer 以斷絕計算機與儀器間之聯機。之后如不分析數據，您可退出軟件“File”à“Quit”(遇有選項永遠選擇“Dont save”)，進行關