1、1實時定量PCRQuantitative Real-Time PCR梁沛中國農業大學昆蟲學系2主要內容n基本原理n幾個概念n絕對定量n相對定量n常見問題3一、基本原理41993年，日本Higuchi 等人首次采用動態PCR的方法和封閉式檢測方式對目的核酸數量進行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術的概念。熒光染料：EB（溴乙錠）PCR儀：改良的熱循環儀激發光：UV射線檢測器：CCD相機缺點：儀器耗費巨大；非特異產物導致定量不準確5n1995年美國PE公司成功開發TaqMan技術n1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等6n實時定量PCR技術

2、（real-time quantitative PCR）是指在PCR反應體系中加入，實時監測整個PCR過程中熒光信號的累積強度，并利用特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。nRT-PCR：Reverse-transcription PCRnqRT-PCR: quantitative Real-time PCR789檢測通道n2004年推出的7300和7500均為第三代產品，2001推出的7900為第二代產品。n7300：4通道n7500：5通道n均需加Rox染料進行校正1011兩種熒光標記法1. 染料染色-SYBR Green I-EB2. 探針標記-Taqman-Taqman MGB-分

3、子信標12SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm1. 熒光染料法熒光染料法13化學原理14染料法的優缺點：n實驗設計簡單，僅需要設計一對上下游引物，不需要設計探針，通用性好；n成本低；n可通過分析檢驗擴增產物的特異性。n低通量實驗一般優先考慮使用SYBR Green I染料法。 15染料法的優缺點nSYBR Green I方法對PCR擴增特異性要求較高SYBR Green I 可與所有的雙鏈 DNA 相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性nSYBR Green I 不能區分不同擴增片段發出的熒光而導致它

4、不能用于多重反應 162. 熒光探針法(Taqman)17Taqman ProbeQuencherReporter18Tagman probe 的工作原理19探針與PCR產物的數量關系n每產生一個新的DNA片段，就切斷一條探針n每切斷一條探針，就產生一個單位的熒光信號n信號強度與DNA的copy數成正比20探針法的優缺點nTagman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產物的干擾影響定量的準確性n可用于多重反應，即可同時檢測多個目的基因。n但探針設計成本較高，有時探針設計困難。 21二、幾個概念221.擴增曲線n描述PCR動態進程的曲線稱為擴

5、增曲線。nPCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數曲線，而是呈S型曲線CyclesFluoresces231.擴增曲線n擴增曲線分三個階段：擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可選擇該階段進行定量分析。 擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。242.熒光閾值n一般把熒光PCR的前15個循環信號作為熒光本底信號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。n是人為設定的一個

6、值，可設在指數擴增階段任意位置上。n缺省設置是315個循環的熒光信號的標準偏差的10倍（自動）。2.熒光閾值25262.熒光閾值n手動設置，原則：大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的最初階段，真正的信號是超過域值的熒光信號。273. Ct值nCycle threshold，就是當擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環次數。線性圖譜半對數圖譜28Ct值的重現性293. Ct值nCt值與模版的拷貝數存在著線性關系，起始拷貝數越多，達到閾值所需的循環數就越少，Ct值也就越小，反之亦然。n正常的Ct值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數據的精度。 3

7、031Ct值定量的數學原理32Ct值定量的數學原理33Ct值定量的數學原理34Ct值定量的數學原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310235靶標基因的定量36靶標基因的定量50001000012需要制備標準品需制作絕對標準曲線無需標準品，需制作相對標準曲線37靶標基因的定量CYP6B6Actin38三、絕對定量39三、絕對定量40三、絕對定量41三、絕對定量1.化學合成目的基因，是純度高、定量準確是受化學合成工藝限制，只能合成120bp以下的長度；2.回收純化PCR產物后

8、克隆到載體上，然后抽提質粒，經過測量濃度和拷貝數的換算，可準確定量是穩定、準確。42三、絕對定量43三、絕對定量(以dsDNA為例） dalton/bp44三、絕對定量n3000 堿基質粒，濃度100 ng/ul nMW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106 daltons。ncopy數 - 3x 1010 copies/ul100ng1.98 x 10645絕對定量舉例Copies/ul Ct 1Ct 2Meant CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280

9、.12510618.6318.9218.770.10Blank46絕對定量舉例擴增效率（擴增效率（E）計算）計算E=10-1/斜率斜率 =10-1/-3.18 =2.06E%=(2.06-1) 100%=106%47絕對定量舉例n如未知樣本Ct為20.5，將Ct值帶入線性方程：n20.5= -3.183 X + 40.211nX=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19n未知樣本拷貝數=106.19=1548816 copies/ul48四、相對定量n無需知道目的基因的絕對拷貝數 1. 模板均一性問題模板均一性問題：起始的細胞數、細胞的狀態、均一性等 2. RNA制備制備：RNA純

10、化得率、均一性等 3. 反轉錄反轉錄：反轉錄的效率等49內標/內參照n因因RNA純化后得率不同、純化后得率不同、RNA反轉錄為反轉錄為cDNA的效率的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度可能不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度可能不同。因此，在進行基因表達研究中都會用看家基因不同。因此，在進行基因表達研究中都會用看家基因（house-keeping gene）對數據進行標準化，以校）對數據進行標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。正因樣品初始濃度不同而造成的差異。n常用的看家基因有：常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等等50相對定量的方

11、法n雙標準曲線法雙標準曲線法nCt法法51雙標準曲線法n優點：優點：分析簡單，實驗優化簡單。n缺點：缺點：對每一個基因每一個基因，每一輪實驗每一輪實驗都必需做標準曲線；必需有固定的標準品做標準曲線；這些標準品并不代表樣品擴增的真實狀態比如標準品為質粒或純化的PCR產物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況。n應用應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一。處理組處理組目的目的基因表達量基因表達量處理組處理組參照參照基因表達量基因表達量對照組對照組目的目的基因表達量基因表達量對照組對照組參照參照基因表達量基因表達量相對表達量相對表達量52Ct

12、法法nCt，即，即Ct的變化值的變化值n假定目的基因和參照基因的擴增效率相同，均為假定目的基因和參照基因的擴增效率相同，均為100%2-(Ct1- Ct2) 2-Ct53Ct法法舉例舉例Cyp6B6 ave Ct18S RNA ave Ct標準化的Cyp6B6 Ct校正Ct處理組處理組22.812.310.5-1.4對照組對照組24.512.611.902-Ct = 54Ct法法n優點：優點：優化的體系建立后，每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。n要求：要求：標準曲線斜率差值70%高效、全長的高效、全長的cDNA61建立反應體系n做普通PCR

13、、跑核酸電泳的槍嚴禁用于定量PCR！n加buffer、引物和水在獨立房間n加模板在另一房間n加模板和其它反應物的移液槍要嚴格區分，不能混用！n增大模板的加樣量，以減少孔間誤差。n使用mix以減少系統誤差；每個樣品至少3個重復62樣品設置6364656667引物設計及評價引物設計的基本原則： 1) 避免重復堿基，尤其是G. 2) 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%. 4) 3端最后5個堿基內不能有多于2個的G或C. 5) 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6) PCR擴增產物長度： 不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）.68引物設計及評價n做溶解曲線Dissociation curve69引物設計及評價70SYBR法常見問題及注意事項特異性擴增產物特異性擴增產物非特異性擴增產物非特異性擴增產物引物二聚體引物二聚體71探針設計原則1.探針位置盡可能地靠近上游引物，擴增片段長度在50150bp范圍內； 2.探針長度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引