1、會計學(xué)1目的目的(md)基因的基因的PCR擴增與檢測擴增與檢測第一頁，共10頁。第1頁/共10頁第二頁，共10頁。PCR方法方法(fngf)體外擴增體外擴增DNA的基本原的基本原理圖示理圖示第2頁/共10頁第三頁，共10頁。預(yù)變性(binxng)(雙鏈DNA解鏈)94C, 5min變性(binxng)(94C ,30s-1min)復(fù)性(f xn)（引物與單鏈DNA結(jié)合）55C,30s-1min 延伸(72C,1-3min)總延伸(72C,5-10min)(25-35cycles)(25-35cycles)PCRPCR的一般過程：的一般過程：經(jīng)過經(jīng)過30次的循環(huán)次的循環(huán), 擴增的擴增的DNA片段

2、可達片段可達100萬倍以上。萬倍以上。第3頁/共10頁第四頁，共10頁。（1）引物長度應(yīng)為）引物長度應(yīng)為1530個核苷酸，個核苷酸，Tm可按下列簡單公式可按下列簡單公式(gngsh)計計算：算： Tm=（G+C）x 4 +（A+T）+35- 2n（2）引物中堿基的分布應(yīng)當(dāng)是隨機的，避免出現(xiàn)一連串的單一堿基或）引物中堿基的分布應(yīng)當(dāng)是隨機的，避免出現(xiàn)一連串的單一堿基或產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。（3） G+C堿基的含量在堿基的含量在45%55 %左右。左右。（4）兩個引物在）兩個引物在3 端均必須與模板互補，端均必須與模板互補，5端可以不互補。端可以不互補。（5）引物自身連續(xù)互補堿基小于）引物自身

3、連續(xù)互補堿基小于4個。個。（6）引物之間連續(xù)互補堿基亦應(yīng)小于）引物之間連續(xù)互補堿基亦應(yīng)小于4。引物設(shè)計的一般引物設(shè)計的一般(ybn)原則原則設(shè)計和選擇高效設(shè)計和選擇高效(o xio)而且特異性好的引物是而且特異性好的引物是PCR的關(guān)鍵的關(guān)鍵第4頁/共10頁第五頁，共10頁。循環(huán)參數(shù)：循環(huán)參數(shù)：變性（變性（denaturation） 變性是高溫短時，變性是高溫短時， 94C ，30s-1min。同時在。同時在第一輪循環(huán)前先進行第一輪循環(huán)前先進行94預(yù)變性預(yù)變性5min，以便，以便使模板使模板DNA完全解鏈。完全解鏈。退火（退火（annealing）實際實際(shj)使用的退火溫度要比引物的使用的退火溫度要比引物的Tm低低5 。 退火溫度在退火溫度在5572 之間都會得到好的結(jié)之間都會得到好的結(jié)果。果。延伸（延伸（extension） 一般引物延伸是在一般引物延伸是在72 下進行。對下進行。對2Kb長的產(chǎn)長的產(chǎn)品擴增時間多采用品擴增時間多采用1min。循環(huán)次數(shù)（循環(huán)次數(shù)（cycle）一般為一般為30個循環(huán)，如果循環(huán)次數(shù)過多會增加非特個循環(huán)，如果循環(huán)次數(shù)過多會增加非特異性產(chǎn)物的量。異性產(chǎn)物的量。第5頁/共10頁第六頁，共10頁。第6頁/共10頁第七頁，共10頁。 1、55 *30s90