1、iTRAQiTRAQ定量蛋白質組學廣州輝駿生物科技有限公司主要內容主要內容 iTRAQ技術簡介技術簡介 iTRAQ試劑標記原理試劑標記原理 iTRAQ技術優勢技術優勢 iTRAQ實驗流程實驗流程 iTRAQ實驗結果示例實驗結果示例 iTRAQ實驗詳細步驟實驗詳細步驟輝駿生物輝駿生物iTRAQ技術簡介 iTRAQ技術是由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年開發的同重標簽標記的相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術。 iTRAQ試

2、劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側鏈氨基）連接的胺標記同重元素。在一級質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。 在一級質譜中，不同來源的相同肽段表現為一個峰； 在二級質譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發生中性丟失，信號離子表現為不同質荷比(114121)的峰，因此根據波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結果結合數據庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類（圖1）。輝駿生物輝駿生物圖1 iTRAQ技術原理圖輝駿生物輝駿生物iTRAQ試劑標記原理iTRAQ試劑包括3部分：報告部分肽反應部分平衡部位(圖2) 報告部分共有8種

3、：質量數分別為114121Da，因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品（客戶可按需選擇標記個數）。 肽反應部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發生共價連接，從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上，幾乎可以標記所有蛋白質。 平衡部分：質量數分別為3124Da，與報告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質荷比。圖圖2 ITRAQ試劑結構試劑結構輝駿生物輝駿生物iTRAQ技術優勢 靈敏度高：靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白； 分離能力強分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等； 適用范圍廣：適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括膜蛋

4、白、核蛋白和胞外蛋白等。 高通量：高通量：可同時對8個樣本進行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析； 結果可靠：結果可靠：定性與定量同步進行，同時給出每一個組分的相對表達水平、分子量和豐富的結構信息； 自動化程度高：自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。輝駿生物輝駿生物iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。 1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質； 2：蛋白質經過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切； 3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標記； 4：等量混合各樣本中的標記肽段； 5：MS/MS質譜檢測及分析。 輝駿生物輝駿生物iTRA

5、Q實驗結果示例1: 提取各組蛋白質、定量并用胰酶酶切；2. 各組肽段分別用4種iTRAQ試劑標記 (例如對照組用iTRAQ 117標記，其他3個實驗組分別用iTRAQ 114, 115, 116標記)；3. 標記好的各組樣本等量混合，液相分離和質譜分析. 4: 不同樣本中蛋白質的差異表達可通過二級質譜中iTRAQ試劑的峰面積確定，如圖所示：與對照組相比，該蛋白在3個處理組(114-116)中的相對表達量較高。5. 根據該肽段的二級質譜峰圖，結合數據庫檢索，得到蛋白的定性信息。輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟ABI試劑盒輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟 1 1：蛋白質提取：蛋白質提取

6、 可以選擇提取蛋白質常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因為這些試劑會干擾iTRAQ試劑的標記反應。輝駿生物輝駿生物輝駿生物輝駿生物輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟2 2：蛋白質定量：蛋白質定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各組樣本的蛋白質進行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據每個涌道染色情況微調蛋白濃度，保證后續實驗中每組樣本的蛋白量相同。輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟3 3：酶切，標記：酶切，標記每組樣本（各100g）分別加入-20預冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20沉淀30min4h（根據樣品所需沉淀

7、量選擇時間，一般開始時可選1小時）；12000rpm 離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolution buffer（20L） 和1% SDS(1L)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2L，混勻，60 反應1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystine blocking regent）1L,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入trypsin酶,37酶解過夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標記試劑中加入50L異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應1h，之后各加入3倍體積的水，使標記試劑分解。標記和樣品對應

8、關系如下:4R117,未知118，BOO6119,11R121；(1)合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟4 4： 除鹽，此步操作是將標記過程中的標記試劑和相關除鹽，此步操作是將標記過程中的標記試劑和相關bufferbuffer的鹽的鹽除去，以便于后續分析。除去，以便于后續分析。 （1）100%乙腈沖洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上 （4）0.1%TFA 沖洗柱子35次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400L洗脫下樣品 （6）將樣品冷凍干燥后進行后續分析。輝駿生物輝駿生物

9、iTRAQ詳細實驗步驟5 5: : 第一維強陽離子柱第一維強陽離子柱(SCX)(SCX)分離分離（1 1）儀器及試劑：）儀器及試劑： 色譜儀20AD(島津) 真空離心濃縮機(Christ RVC 2-25，Christ，Germany) 磷酸二氫鉀(國藥集團) 氯化鉀(國藥集團) 乙腈ACN(Fisher)（2 2）具體操作參數）具體操作參數 柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A, The Nest Group,Inc.MA A相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6 B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25

10、%ACN，PH 2.6 紫外檢測波長：214nm/280nm 流速：200L/min 梯度：60min輝駿生物輝駿生物 B% B%從從5 5分鐘分鐘5%5%到到4040分鐘上升至分鐘上升至25%25% Time(min) B% 0 0 5 5 40 25 45 80 50 80 51 0 60 stop 根據峰型和時間共收取20個梯度,真空離心濃縮后，用50L RPLC A相5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)溶解，進行第二維分析。輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟6 6: : 第二維反相液質聯用第二維反相液質聯用RPLC-MSRPLC-MS（1 1）儀器及試

11、劑）儀器及試劑 色譜儀20AD(島津) 質譜儀 QSTAR XL（Applied Biosystem,USA） 乙腈ACN(Fisher) 甲酸（TEDIA）（2 2）具體操作參數）具體操作參數 反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 m, 300A, 0.1 x 150mm ，microm ,USA) 色譜分離90min，梯度B%從5分鐘5%到70分鐘上升至35%。 A相：5%ACN,0.1%甲酸 B相：95%ACN,0.1%甲酸 流速： 300nL/min輝駿生物輝駿生物 Time(min) B% 5 5% 90 35% 95 80% 100 80% 105 5% 120 stop質譜鑒定：MS掃描范圍400-1800 MS/MS掃描范圍100-2000 IDA 采集模式 一個圖譜選擇四個最強的母離子進行串級掃描。輝駿生物輝駿生物iTRAQ詳細實驗步驟7 7: : 數據檢索數據檢索(1)(1)蛋白質檢索蛋白質檢索 檢索軟件：Protein Pilot 3.0 (A