1、水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位邱結華馬寧,蔣漢偉,圣忠華邵高能唐紹清魏祥進,胡培松,(中國水稻研究所/農業部水稻生物學與遺傳育種重點實驗室/水稻生物學國家重點實驗室,杭州;杭州師范大學生命與環境科學學院,杭州;通訊聯系人,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)IdentificationandGeneMappingofaLesionMimicMutantlmminRiceQIUJiehua,MANing,JIANGHanwei,SHENGZhonghua,SHAOGaoneng,TANGShaoqing,WEIXiangjin,HUPeiso

2、ng,(StateKeyLaboratoryofRiceBiology,KeyLaboratoryofRiceBiologyandBreedingofMinistryofAgriculture,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou,China;Correspondingauthor,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)QIUJiehua,MANin

3、g,JIANGHanwei,etalIdentificationandgenemappingofalesionmimicmutantlmminriceChinJRiceSci,():Abstract:ThelesionmimicmutantlmmwasidentifiedfromanEMSinducedNipponbaremutantlibraryBrownlesionswerefirstobservedonthetipoflmmleavesattheinitialtilleringstage,andspreadedgraduallydownwardtothewholeleafbladeand

4、eventheleafsheathComparedwiththewildtype,thechlorophyllandthenetphotosyntheticrateoflmmweresignificantlyreducedTheplantheight,paniclelength,seedsettingrate,grainweightwerealsodecreasedsignificantlyTheshadingassayshowedthatthelesionsonlmmleaveswereinducedbynaturallightThehistologicalstainingassayindi

5、catedthatthelesionsonlmmleaveswerecausedbyprogrammedcelldeathandhydrogenperoxideaccumulatedinlmmleavesThelmmdisplayedhigherresistancetoblastraceCandGwhencomparedwiththewildtypeInaddition,pathogenesisrelatedgenePOC,PAL,PBZ,PRwerefoundtobeupregulatedinlmmGeneticanalysissuggestedthatthephenotypeoflmmwa

6、scontrolledbyasinglerecessivenuclearlocusBasedamapbasedcloningstrategy,thelmmwasnarroweddowntoakbregionbetweenIndandIndnearthecentromereofchromosomeKeywords:lesionmimicmutant;blastresistance;genemapping;rice邱結華,馬寧,蔣漢偉,等水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位中國水稻科學,():摘要:在EMS誘變的日本晴突變體庫中,篩選到一個類病斑突變體.該突變體類病斑出現于分蘗始期,而后慢慢擴

7、散至葉鞘、莖稈,最后至整個植株,屬于擴散型類病斑突變體.相比野生型,突變體的lmm的株高明顯降低,有效穗數減少,穗長縮短,結實率、每穗實粒數、千粒重均顯著降低.遮光處理實驗表明,突變體lmm類病斑的產生受自然光誘導.突變體lmm的光合色素含量和凈光合速率明顯低于野生型.電子顯微鏡觀察發現突變體類病斑部位葉肉細胞中的葉綠體結構發育異常.臺盼藍染色實驗表明突變體類病斑部有大量的死亡細胞.二氨基聯苯胺染色實驗表明類病斑部位有過氧化氫沉積.稻瘟病抗性鑒定結果表明,與野生型相比,突變體lmm對C和G等稻瘟病菌生理小種的抗性明顯增強.實時PCR分析證明在突變體lmm中防衛反應相關基因POC、PAL、PBZ

8、、PR的表達量顯著提高.遺傳分析表明突變體表型符合單隱性核基因控制的遺傳規律.lmm定位在第染色體著絲粒附近Ind和Ind之間大約kb的區域內.關鍵詞:類病斑突變體;稻瘟病抗性;基因定位;水稻中圖分類號:Q;Q;S文獻標識碼:A文章編號:()植物類病變(lesionmimicmutant)突變體是指在無明顯逆境或病原物侵染時,植物葉片或葉鞘上自發形成大小、形狀和顏色各異的斑點的一類突變體.又因為多數類病變突變體形成的斑點與無毒病原物浸染時產生的病斑類似,并且大多數斑點的顏色為褐色,也常被稱之為類病斑(lesionsimulatingdisease)突變體.類病斑突變體的表型多與病原菌侵染后的超

9、敏反應(hypersensitiveresponse,HR)癥狀類似,而且許多類病變突變體對某些植物病原物表現出了一定的抗性.因此,對這類突收稿日期:;修改稿收到日期:.基金項目:國家自然科學基金資助項目(,);國家計劃資助項目(AAA,AA).中國水稻科學(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn變體的研究可以為水稻抗病防御體系和細胞程序性死亡機制的研究提供借鑒,同時可以為水稻抗性育種提供有用的種質資源.水稻類病斑突變體的研究已有大量報道,到目前為止,已經發現了多個類病斑突變體.其中,絕大部分呈單隱性核基因遺傳規律,少部分表現為雙隱性核基因或

10、顯性核基因遺傳規律,但被克隆的類病斑基因卻為數不多.在水稻中第一個被克隆的類病斑基因是SPL,該基因編碼一個熱激轉錄因子,spl突變體在該基因非常保守的DNA結合域發生突變,從而導致其斑點葉表型的發生.隨后不同研究者利用圖位克隆、同源基因克隆、TDNA序列標簽等方法克隆與分離了Spl、Spl、Spl、OsLSD、OsPtia、OsNPR、OsSSI、OsACDR、RLIN、RLS等多個水稻類病斑性狀相關基因.這些已經克隆基因的突變體表現出不同類型、不同程度的類病斑表型,部分突變體還表現出比其野生型更好的稻瘟病、白葉枯病抗性.如水稻類病斑突變體lsd對毒性稻瘟病菌小種的抗性明顯增強;而水稻突變體

11、npr和acdr對白葉枯病的抗性提高,.水稻類病斑突變體spl、spl、ttm、spl和ssi同時對稻瘟病和白葉枯病產生抗性.同時,類病斑基因大多直接調控或間接影響水稻的防衛反應與細胞程序性死亡過程.類病斑基因的克隆與功能研究表明類病變過程非常復雜,涉及到許多生化代謝過程.因此,挖掘更多的類病斑突變體,克隆更多的相關基因,并開展詳細的功能研究,有助于全面了解類病變發生機制,同時為研究水稻細胞程序性死亡和抗病機制提供借鑒.本研究以粳稻品種日本晴EMS誘變產生的一個穩定遺傳的類病斑突變體lmm為材料,詳細描述了該突變體的形態學特征、生理學特性,并對該突變基因進行了精細定位,以期為該基因的克隆、功能

12、研究及應用提供理論依據.材料與方法實驗材料從日本晴EMS誘變突變體庫中篩選到一個類病斑突變體lmm,經多代自交后類病斑性狀在海南和杭州都能穩定遺傳.以lmm與秈稻品種南京和培矮雜交衍生的F及F群體對lmm進行遺傳分析,利用lmm與南京、培矮衍生的F群體對突變體基因進行分子定位.所有材料均于正季種植于中國水稻研究所富陽試驗基地,田間管理同大田生產.遮光處理在大田自然條件下,用寬度約cm的錫箔紙對突變體lmm分蘗時期的葉片進行包裹遮光,分別對未發和已發生類病斑的葉片遮光一周;然后對遮光處揭掉錫箔紙恢復光照,跟蹤觀察類病斑變化.葉綠素含量的測定分別取大田自然條件下突變體lmm及其野生型分蘗期、抽穗期

13、和成熟期的葉片進行葉綠素含量測定.將g待測樣品剪成mm的小片浸泡于mL乙醇,黑暗條件下放置于的冰箱中,浸提h左右.利用分光光度計測量乙醇溶液的吸光值,每組取份樣品,每份樣品重復測量次.按Lichtenthaler等修正的Arnon法計算葉片葉綠素含量.光合作用相關指標的測定使用Li型便攜式光合測定儀,于始穗期晴天上午:分別測定突變體lmm及其野生型葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO濃度(Ci).突變體和野生型各測定片具代表性的劍葉,光合測定儀使用紅藍光源,光量子密度mol/(ms),流速mol/s.葉綠體結構電鏡觀察分別取分蘗期野生型正常葉片與突變體lmm發

14、生類病斑葉片,置于戊二醛固定液中,抽真空使固定液完全滲入葉片中,電鏡樣品制備參照呂典華等的方法,樣品制備好后利用HITACHI型透射電子顯微鏡對葉肉細胞中葉綠體的顯微結構進行觀察.葉片死亡細胞檢測參照Yin等的方法分別取分蘗期有類病斑表型的突變葉片以及相應位置的野生型正常葉片用臺盼藍染色,使用體視鏡(LeicaDM)觀察突變體和野生型葉片中染色情況并拍照.葉片HO沉積檢測參照ThordalChristensen等的方法檢測突變體葉片中是否有HO的積累.中國水稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)突變體抗性鑒定為了了解類病斑突變體lmm對稻瘟病的抗性,將lmm和野生型品種浸種、催芽后

15、,按順序分別播種在××的有孔、裝有細土的塑料盤中,每盆播個,每個供試品種播粒粒,設個重復,接種前d施氮肥,保持嫩綠;在秧苗葉期接種;選擇A、A等致病性較強和致病頻率較高個菌株對lmm及其野生型秧苗噴霧接種,病菌濃度約為×個孢子/mL.接種量以所有葉片上布滿孢子液為限,覆蓋黑色濕布保濕h,然后取出,定時噴霧保濕.d后當感病對照品種麗江新團黑谷病級達級以上時進行調查.基因定位從突變體lmm與南京衍生F群體中首先挑選出株表型為類病斑的分離單株用于lmm的連鎖分析.利用本實驗室均勻分布于條染色體的對公共引物對親本進行篩多態分析,所用引物來自Matsumoto等采用的公共序

16、列.初步確定目標基因所在的染色體位置.然后在與目標基因連鎖標記附近進一步開發了對存在多態的SSR標記或Indel標記(表),以株表現出類病斑表型的分離單株對突變體基因lmm進行進一步定位.為了更精細定位lmm突變體基因,同時利用突變體與培矮衍生的F群體中表現突變體性狀的個分離個體對突變體基因進一步精細定位.親本和定位群體F的植株基因組的DNA采用SDS法提取,L的PCR體系包括DNAL,×PCR緩沖液L,正反向引物(mol/L)各L,dNTPs(mol/L)L,Taq酶L,加ddHO補足L.PCR程序如下:下預變性min;下s,下s,下s,個循環;最后在下延伸min.PCR產物在非變

17、性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳,電泳結束后銀染顯色并讀膠.防衛反應相關標記基因的表達分析采用Trizol法提取突變體和野生型植株分蘗期葉片總RNA.以經過DNase處理過的總RNA為模板,采用ReverTraAceFskkit(TOYOBO)反轉錄合成cDNA第鏈.然后利用實時熒光定量PCR方法分析各基因在突變體和野生型中的表達量.內參基因為Actin(GenBank登錄號為X).實時熒光定量PCR反應體系(L)包含cDNA模板L,×SYBRqPCRMix(TOYOBO)L,前后引物(mol/L)各L,ddHOL.每個樣品個重復.PCR擴增程序如下:下s;下s,下s,下s,個循環.以CT

18、計算各基因相對表達量.用于檢測防衛反應相關標記基因的表達引物見表.結果與分析突變體lmm的表型在大田自然條件下,突變體lmm苗期葉片與表定位突變體基因lmm所用的引物序列TablePrimersequenceusedforlmmmapping標記Marker前引物Forwardprimer后引物ReverseprimerQTTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAGQTGGCGCAATATCTCTCTCATTCCTGCCACTTGTGTGTTGTTCTGCQCGAGGGGATTCGATCGACATCCCTTCACACTGCTCCACQGGCGTAAAGGTTTT

19、GCATGTATGATGCCATGAAGGTCAGCQCGTAAACACGAGCACACAAAGGACACACAACAGCTGCTCACTGGIndATGTCCTAATTTTCACCCAGATTTCCATAGCAGACTTATTTCAGIndGCCTAGTGGTGGAAGCATTTAAACCGGCAGGTCTGAIndTGGTTACAATAGTGCCTCACACATAATTGCTAGTAGTTAGAGIndAGTTTCTGGGTTAGGGATGTTATGAGGGTGCTGTTGGIndAAAGTCAAACGTGGACAAGCACTGGCAATTCGCTCAIndCCAAAAGTCAACCTGG

20、AACACAAATTAAATTAGGCATGIndAAATCCGAAGCGCCACTATTGATGCGGCACATCCTAQQ是SSR標記;IndInd是插入缺失標記.QtoQareSSRmarkers;IndtoIndareinsertdeletemarkers邱結華等:一個水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位A野生型(左)和突變體lmm(右)分蘗期的植株表型;B野生型(左)和突變體lmm(右)的分蘗期葉片;C野生型(左)和突變體lmm(右)成熟期的植株表型;D野生型(左)和突變體lmm(右)的成熟期葉片.A,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(righ

21、t)duringthetilleringstage;B,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthetilleringstage;C,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage;D,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage圖類病斑突變體lmm的表型FigPhenotypesoflmmmutant其野生型一致,并沒有類病斑,但是在分蘗期后期lmm植株上部葉片

22、從葉尖開始出現紅褐色類病斑(圖AB).隨著水稻的生長,類病斑的數量逐漸增加并向整片葉片擴張,同時單個類病斑的面積也會不斷變大(圖CD),因此,突變體lmm屬于擴散型類病斑突變體.另外,相比野生型突變體,lmm植株較為矮小,株高明顯降低,結實率顯著降低,每穗實粒數、千粒重均減少.相對于野生型,表防衛反應標記基因表達分析引物TableTheprimersforRTPCRofpathogenesisrelatedmarkergenes基因Gene前引物Forwardprimer后引物Reverseprimer登錄號AccessionNoPRGTAAACAGGTCCACGGTCCATACCCCAGTG

23、ACAACTGACAAGGCAAAUPBZCGGGCACCATCTACACCAGCCATAGTAGCCATCCACDPALGGCATCCAGGGCGGCTTCTTCGGTCTTGCTTCGGCTTCATCAGXPOCTTCAACAACGGCAGCACGGACAATGGAACAAGAAACAGAGCAAGGCAAATCAFPOXAGTGCCAGAACTTCAGGGACAGGATCTACAACAACGAACGCATCCCGTCATACTACTCCAFActinCATGCTATCCCTCGTCTCGACCTCGCACTTCATGATGGAGTTGTATX表突變體和野生型的主要農藝性狀TableThe

24、agronomictraitsoflmmandwildtype(WT)材料Material株高Plantheight/cm結實率Seedsettingrate/千粒重grainweight/g每穗實粒數Nooffilledgrainsperpanicle野生型WT±±±±突變體lmm±±±±,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively;Mean±SD(n)中國水

25、稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表突變體lmm與野生型始穗期劍葉的光合特性TablePhotosyntheticcharactersoflmmmutantandwildtype(WT)atheadingstage材料Material凈光合速率(Pn)Netphotosyntheticrate氣孔導度(Gs)Stomatalconductance蒸騰速率(Tr)Transpirationrate胞間CO濃度(Ci)IntercellularCOconcentration野生型WT±±±±突變體lmm±±±&#

26、177;,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectivelyMean±SD(n)A,日本睛;B,遮光前lmm;C,未發生斑點部位遮光d后;D,遮光部位恢復光照d后;E,已發生斑點部位遮光d后.A,Nipponbare;B,Leafoflmmbeforeshading;C,Leafwithoutlesionaftershadingfordays;D,Leafshadedfordaysthenundernormallightfordays;E,Leaf

27、withlesionaftershadingfordays圖遮光對突變體lmm葉片的影響FigEffectsofShadingonlmmleaveslmm表現一定的早衰現象(圖A,表).突變體lmm類病斑發生受光照誘導對突變體lmm只在葉尖出現少量類病斑的葉片未產生類病斑部位用錫箔紙遮光一周后發現,整張葉片其他部位都產生了明顯的類病斑,但是遮光處并沒有類病斑產生(圖AC);恢復光照一周后,原本沒有類病斑的遮光處產生了明顯的類病斑(圖D);同時,對已經產生的類病斑的葉片進行遮光,一周后發現已產生的類病斑并不會消失,但是其他部位類病斑擴散嚴重,遮光處沒有擴散(圖E).該結果表明突變體lmm的類病斑

28、發生受自然光照誘導,適當的遮光可以阻止或減輕類病斑的發生或擴散.光合色素含量及光合速率分析對大田自然環境下分蘗期、抽穗期和成熟期三個時期野生型和突變體lmm葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量進行測定,結果表明,在分蘗期(類病斑起始期),突變體和野生型各色素指標差異不大,但在抽穗期(類病斑已形成),lmm的葉綠素、類胡蘿卜素含量明顯低于野生型,到成熟期,突變體的各色素含量都極顯著低于野生型(圖).表明lmm的突變導致了水稻葉綠素、類胡蘿卜素含量的降低.為進一步了解lmm類病斑的發生是否影響了其光合作用,我們在田間測量了齊穗期的突變體和野生型的各個光合作用指標(表),結果表明lmm的凈光合速率、氣孔導度和

29、蒸騰速率顯著低于野生型,而胞間CO濃度則顯著高于野生型,這表明lmm的突變影響到了水稻葉片的光合作用.葉綠體顯微結構觀察分別對突變體lmm有類病斑表型的葉片和野生型的葉片進行葉綠體結構的電鏡觀察.結果顯示野生型葉肉細胞葉綠體數目較多,基質較濃厚,基粒片層垛疊較厚,排列緊密,具有較多的淀粉粒(圖AB).突變體lmm葉肉細胞內的葉綠體數目較少,葉綠體中的內囊體退化成小泡狀,并且具有較多的嗜餓小體,較少的淀粉粒(圖CD).該結果表明突變體lmm葉片由于類病斑的產生導致了葉肉細胞中的葉綠體結構的發育異常.突變體lmm葉片發生細胞程序性死亡和HO的沉積利用臺盼藍染色方法對突變體lmm及其野生型葉片中死亡

30、細胞進行檢測,結果顯示野生型葉片沒有深藍色染色,說明野生型葉片基本上沒有細胞死亡(圖AB);但是突變體葉片染色后整體呈淡藍色,類病斑發生處對應著嚴重的深藍色斑點,說明斑點部位有大量的細胞死亡,而在大塊深藍色染色間隙也出現了深藍色的小點,說明類病斑正在擴展中(圖CD).該結果表明lmm葉片類病斑的形成和發展可能是一個細胞程序性死亡的過程.邱結華等:一個水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively

31、圖突變體lmm和野生型不同生育期葉片光合色素含量分析FigPigmentcontentinleavesoflmmandwildtype(WT)duringdifferentgrowthstages植物細胞程序性死亡時常產生活性氧的沉積.利用二氨基聯苯對突變型和野生型葉片進行染色,結果顯示野生型中基本沒有HO沉積的紅褐色斑點(圖EF),突變體lmm有大量的HO沉積紅褐色小斑點產生(圖GH),表明lmm突變體類病斑發生可導致水稻葉片細胞活性氧的積累.突變體lmm對稻瘟病的抗性利用個稻瘟病菌株分別噴霧接種突變體lmm及其野生型進行苗期稻瘟病抗性檢測,接種d后當感病對照品種病情指數達級以上時調查,突變

32、體lmm對B、B、B、C、G稻瘟病菌生理小種的抗性相對野生型明顯下降,但對C、G、C、D、E、C、D、G稻瘟病生理小種抗性增強,特別是突變體lmm對C和G稻瘟病生理小種表現為高抗(圖).防衛反應標記基因的表達分析利用熒光定量PCR技術分析了防衛反應標記基因PeroxidaseC(POC)、Phenylalanineammonialyase(PAL)、Probenazoleinducedprotein(PBZ)、Pathogenesisrelatedclass(PR)、Peroxidase(POX)在突變體lmm及其野生型中的表達情況,結果顯示,POC、PAL、PBZ、PR在lmm中的表達量顯著

33、或極顯著高于野生型(圖).說明突變體lmm的類病斑產生激發了水稻中與抗性相關的一些防衛反應基因的表達.突變體的遺傳分析與分子定位突變體lmm分別與秈稻品種培矮和南京配制的F家系均類似于其野生型,沒有類病斑發生,相對應的兩個F群體中均發生正常植株和類病斑表型植株分離,分離比例符合分離比()(表),表明突變體lmm類病斑性狀符合單隱性核基因控制的遺傳規律.從突變體lmm與南京衍生的F群體中挑選出株表現為類病斑的分離單株將目標基因初步定位在第染中國水稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A,B野生型的葉肉細胞和葉綠體結構;C,D突變體的葉肉細胞和葉綠體結構.N細胞核;CP葉綠體;SG淀粉

34、粒;OG嗜鋨小體;TM內囊體膜.A,B,Ultrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellofwildtype;C,D,UltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcelloflmmN,Nucleus;CP,Chloroplast;SG,Starchgranule;OG,Osmiophilicplastoglobuli;TM,Thylakoidmenbranes圖野生型和突變體lmm葉肉細胞核葉綠體顯微結構FigUltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellof

35、wildtypeandlmmAD為臺盼藍染色;EH為二氨基聯苯染色.A、C、E和G為染色前;B、D、F和H為染色后A,B,E,F為野生型葉片;C,D,G,H為突變體葉片.D圖箭頭指示的是細胞死亡著色斑;H圖箭頭指示的是過氧化氫沉積點.AD,Ttrypanbluestainingoftheblade;EH,DiaminobenzidinedyeingofthebladeA,C,EandG,Thebladebeforestaining;B,D,FandH,ThebladeafterstainingA,B,E,FarebladesofWT;C,D,G,HarebladesoflmmThearrowi

36、nDindicatecelldeathstainspot;ThearrowinHindicatetheaccumulatedHOstainspot圖lmm突變體的組織化學分析FigHistochemicalanalysisofthemutantlmm色體著絲粒附近的SSR標記Q和Q之間(圖A).為了進一步精細定位lmm基因,在Q和Q之間進一步開發對有多態性的SSR標記和對有多態的Indel標記,利用個表型為類病斑的F分離單株,最終將該基因定位在ind和ind之間大約kb的區域內(圖BC),該區域橫跨OSJNBaC、OSJNBbK、OSJNBbB、OSJNBbA這四個BAC(圖D).討論目前,在

37、水稻中已經發現了大量的類病斑突變體.這類突變體除了在無明顯逆境或病原物侵染時,葉片或葉鞘上自發地形成大小、形狀和顏色各異的類似病原物侵染時發生的病斑外,通常還伴隨著其他各種農藝性狀的改變.如突變體spl不但表現出類病斑的表型,而且在開花后該突變體植株的葉片會迅速衰老,最后在成熟期死亡,表現出嚴重的早衰現象.RLS基因的突變也會加速植株的衰老,表現出早衰的現象.Takahashi等鑒定的OsPtia基因突變后植株表現出嚴重的矮化現象.邱結華等:一個水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位表lmm的遺傳分析TableGeneticanalysisofthelmm雜交組合Hybridcombinat

38、ion正常表型植株數Noofnormalplants突變表型植株數Noofmutantplants卡方值()ChisquareP值Pvalue南京Nanjing/lmm培矮Peiai/lmm圖突變體lmm稻瘟病抗性鑒定FigResistanceidentificationoflmmandwildtype(WT)toriceblastPOC過氧化氫C基因;PAL苯丙氨酸氨裂解酶;PBZ噻菌靈誘導蛋白基因;PR病程相關基因;POX過氧化氫基因.,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.POC,PeroxidaseC;PAL,Phenylalanineammonialyase;PBZ,Proben

39、azoleinducedprotein;PR,Pathogenesisrelatedclass;POX,Peroxidase,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively圖防衛反應基因定量表達分析FigExpressionanalysisofdiseaseresistancegenesFeng等年鑒定的HM突變體株高、分蘗數、穗長、每穗粒數、結實率和千粒重都顯著低于其野生型.本研究鑒定的類病斑突變體lmm從分蘗期開始產生類病斑,之后類病斑的數量逐漸增加,單個類病斑的面積也會不斷

40、變大,直至整個植株覆蓋嚴重的類病斑,因此lmm屬于典型的擴散型類病斑突變體.除此之外,相對于野生型,突變體lmm的株高明顯降低,有效穗數減少,穗長縮短,結實率、每穗實粒數、千粒重均顯著降低.因此lmm基因表現出對水稻正常生長發育具有“一因多效”的重要作用.類病斑突變體出現類病變壞死突變的原因非常復雜,主要受基因突變的控制外,同時也存在許多環境誘發因素,如光、溫度、濕度等.水稻類病斑突變體spl在高溫()和紫外線的誘導下產生斑點.擬南芥lin突變體類病變表型則受長日照誘導產生.Noutoshi等發現slh突變體的類病斑表型受低濕度誘導產生.本研究中的突變體lmm類病斑表型的產生受自然光照的誘導,

41、對未發生類病斑的葉片遮光處理可以阻止類病斑形成,對已發類病斑的葉片遮光則可以阻止病斑組織的擴中國水稻科學(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A突變體基因lmm與SSR標記Q、Q連鎖;B利用個F分離單株將lmm定位在Q與Q之間;C利用個F分離單株將lmm定位與Ind和Ind約kb的區間;D目標區域覆蓋個BAC.A,lmmwaslinkagedwithSSRmarkersQandQ;B,lmmwaslocatedbetweenQandQbasedonseparatedFplants;C,lmmwaslocateddownkbregionbetweenIndandIndbasedonsepa

42、ratedFplants;D,lmmtargetregioncontainingfourBAC圖lmm突變體基因的精細定位FigFinemappingoflmm大(圖).由于類病斑突變體類病斑的產生與植物受病原物侵染發病而產生組織壞死類似,而早前研究發現許多的類病斑突變體對某些植物病原物表現出了比野生型更好的抗性.如水稻spl、spl和spl突變體對稻瘟病病菌和白葉枯病菌的抗性有所提高,;王建軍等發現lrd和lrd對白葉枯病菌具有廣譜型抗性.而本研究發現我們鑒定的lmm突變體也表現出對多個稻瘟病生理小種具有一定的抗性,尤其對C和G兩個生理小種的抗性明顯增強(圖).類病斑突變體對病原物表現出一定

43、的抗性,有可能是因為影響了一些防衛反應標記基因表達.如水稻類病斑突變體Oslsd具有明顯的稻瘟病抗性,其植株內的防衛反應標記基因PR和PBZ表達顯著提高;突變體ttm同時對稻瘟病和白葉枯病表現出抗性,其體內防衛反應標記基因PRb、PR、PRa和PAL的表達量都增加.在本研究中,突變體lmm中防衛反應標記基因POC、PAL、PBZ、PR的表達也出現了明顯上調(圖).因此,類病斑突變體的類病斑產生機理的研究也對植物抗病機理及細胞程序性死亡等相關研究具有重要借鑒意義.雖然國內外許多學者對植物類病斑產生機制進行了廣泛的研究,但是由于類病斑的形成機制十分復雜,同時也受溫度、光照等自然條件的影響,類病斑的

44、形成機制目前仍然不是十分清楚,因此還需要更多相關基因的克隆與功能研究.目前在第染色體上共鑒定出個水稻類病斑基因spl、spl和OsPtia.其中spl暫無定位信息,另外兩個已經被克隆,其中spl位于第染色體長臂末端;而OsPtia位于第染色體短臂末端.本研究定位到的lmm位于第染色體著絲粒附近,因此lmm是一個新的類病斑基因.本研究關于突變體lmm的生理學、細胞學及分子遺傳學研究為lmm基因的克隆與功能研究打下了基礎,對于探索水稻類病斑發生機制及抗病反應機制具有重要意義.參考文獻:HuG,RichterTE,HulbertSH,etalDiseaselesionmimicrycausedbym

45、utationsintherustresistancegenerpPlantCell,():DanglJL,DietrichRA,RichbergMHDeathdonthavenomercy:CelldeathprogramsinplantmicrobeinteractionsPlantCell,():陳析豐,金楊,馬伯軍水稻類病變突變體及抗病性的研究進展植物病理學報,():王建軍,朱旭東,王林友,等水稻類病變突變體lrd的抗病性與細胞學分析中國水稻科學,():邱結華等:一個水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位QiaoYL,JiangWZ,LeeJH,etalSPLencodesaclat

46、hrinassociatedadaptorproteincomplex,mediumsubunit(APM)andisresponsibleforspottedleafandearlysenescenceinrice(Oryzasativa)NewPhytol,():黃奇娜,楊楊,施勇烽,等水稻斑點葉變異研究進展中國水稻科學,():YamanouchiU,YanoM,LinH,etalAricespottedleafgene,Spl,encodesaheatstresstranscriptionfactorproteinProcNatlAcadSci,():ZengLR,QuSH,Bordeo

47、sA,etalSpottedleaf,anegativeregulatorofplantcelldeathanddefense,encodesaUbox/armadillorepeatproteinendowedwithEubiquitinligaseactivityPlantCell,():WangLJ,PeiZY,TianYC,etalOsLSD,aricezincfingerprotein,regulatesprogrammedcelldeathandcallusdifferentiationMolPlantMicrobeInteract,():YuanYX,ZhongSH,LiQ,et

48、alFunctionalanalysisofriceNPRlikegenesrevealsthatOsNPR/NHisthericeorthologueconferringdiseaseresistancewithenhancedherbivoresusceptibilityPlantBiotechnolJ,():KimJA,ChoK,SinghR,etalRiceOsACDR(Oryzasativaacceleratedcelldeathandresistance)isapotentialpositiveregulatoroffungaldiseaseresistanceMolCell,():MoriM,TomitaC,SugimotoK,etalIsolationandmolecularcharacterizationofaSpottedleafmutantbymodifiedactivationtagginginricePlantMolBiol,():TakahashiA,AgrawalGK,YamazakiM,etalRicePtiane