1、免疫組織化學 （一）、儀器設備1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；2）水浴鍋（二）、試劑1）PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g.3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml.4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在80

2、0ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml.5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱劑：a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合；b、油和TBS（或PBS）配制。8）TBS/PBS pH9.09.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.07.4適合于光學顯微鏡標本。（三）、操作流程1、脫蠟和水化脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。1）組織

3、芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；2）無水乙醇中浸泡5分鐘；3）95%乙醇中浸泡5分鐘；4）70%乙醇中浸泡5分鐘；2、抗原修復用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。1）抗原熱修復（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH

4、6.0）至95左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋

5、白酶使用前預熱至37，切片也預熱至37，消化時間約為530分鐘；胃蛋白酶消化37時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫組織化學染色SP法1）脫蠟、水化；2）PBS洗23次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗23次各5分鐘； 5）抗原修復；6）PBS洗23次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加抗50l，室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。9）4過夜后需在37復溫45分鐘。10）PBS

6、洗3次各5分鐘；11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時；12）II抗中可加入0.05%的tween-20.13）PBS洗3次各5分鐘；14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS或自來水沖洗10分鐘；16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；17）自來水沖洗1015分鐘；18）脫水、透明、封片、鏡檢。SABC法1）脫蠟、水化。2）PBS洗兩次各5分鐘。3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。4）抗原修復。5）PBS洗5分鐘。6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7）滴加抗，室溫1小時或者4過夜或者371小時（4過夜

7、后在37復溫45分鐘）。8）PBS洗三次每次2分鐘。9）滴加生物素化二抗，203720分鐘。10）PBC洗3次每次2分鐘。11）滴加試劑SABC，203720分鐘。12）PBS洗4次每次5分鐘。13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。15）脫水、透明、封片、鏡檢。原位雜交實驗原理與方法一、目的本實驗的目的是學會原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的基本原理和優缺點。二、原理原位雜交組化（簡稱原位雜交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）屬于分子雜交的一種，是一種應用

8、標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物相關的檢測系統，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術。原位雜交的本質就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補規則與組織細胞內待測的核酸復性結合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標記的檢測系統將其在核酸的原有位置上顯示出來。當然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。探針的種類按所帶標記物可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。目前，大多數放射性標記法是通過酶促反應將標記的基因摻入DNA中

9、，常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定

10、于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。 組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。（一）探針的選擇根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，

11、在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80150bp）具有較大的優越性。在選用探針時經常會受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類

12、和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時，可采用PCR方法擴增某段基因序列，并克隆人合適的質粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。（二）探針的標記方法在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探

13、針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩定的堿性磷酸酶顯示系統。（三）探針的濃度總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為510 ng/ml和251000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.55.0g/ml。探針的任何內在物理特性均不影響

14、其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。（四）雜交率在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度）和探針濃度。（五）雜交最適溫度雜交技術最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 1015，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30），雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫

15、度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。最適復性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm 25苛刻復性溫度：Ts = Tm （10或15）非苛刻復性溫度：Tns =Tm （30或35）（六）雜交的嚴格性影響雜交體穩定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體?（七）雜交反應時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈

16、起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中 未標記的DNA 400g/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1g/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。 Tm值25時雜交最佳，所以首先要根據公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。 （八）雜交促進劑惰性

17、多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（60008000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%10%PEG則可產生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%4%。與硫酸

18、葡聚糖相比，其優點是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。（七）雜交反應時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于

19、保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400g/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1g/ml）來說Cot值為0

20、.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。 Tm值25時雜交最佳，所以首先要根據公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。（八）雜交促進劑惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（60008000）、粘度低、價格低廉，但它

21、不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%10%PEG則可產生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%4%。與硫酸葡聚糖相比，其優點是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用

22、。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。三、主要器材醫用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。四、試劑（二）  試劑:  2.5ml/L 的醋酸2.5ml/L醋酸酐: 三乙醇胺 13.2ml氯化鈉 5g濃鹽酸 4ml醋酸酐（用前加） 2.5ml；  20×SSC（pH7.0）：氯化鈉 175.3g枸櫞酸鈉 88.2g雙蒸水定容至1L；  100×Denhardts: Ficoll 1g PVP 1gBSA 1gddH2O 定容至50ml

23、；   雜交液：（50ml） 用量 終濃度100%去離子甲酰胺 25ml 50%100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%100×Denhards 0.5ml 11Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm5M NaCl 3ml 0.3M 0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/mlddH2O定容至25ml  0.1M甘氨酸/PBS:甘氨酸 7.5gNa2HPO4 30.8gNaH2PO4 2.8gNaCl 8.5g溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲存；TSM1 （

24、1000ml）：1MTris-HCL（PH8.0） 100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 10mlddH2O定容至1000ml；TSM2 （1000ml）：1MTris-HCL（PH8.0） 100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 50mlddH2O定容至1000ml；  抗體稀釋液： 100mlBSA 1.0gTris X-100 0.4ml疊氮鈉 0.4g0.05M PBS （PH7.2）調至100ml；  0.05M PBS （PH7.2）：1000mlNa2HPO4 15.4gNaH2PO4 1.4gNaCl 4.25g去內源性酶液（40m

25、l）：儲存液 用量 終濃度10%甲醛 4.0ml 0.30.5%冰醋酸 10.0ml 25.0%加0.05MPBS至40ml  0.4% Triton-X 100五、操作（一）  脫蠟，水化：1、  二甲苯10min 兩次2、 無水乙醇3min 兩次、95%乙醇3min 一次、75%乙醇3min 一次、50%乙醇2min 一次、重蒸水2min 一次、PBS洗滌5min （二）  將組織芯片放入去內源性酶液中浸泡30min；PBS洗滌5min（三） 0.1M甘氨酸去游離醛基 15min；0.4%tritonX-100 洗10min；（四） 用蛋白酶K與37

26、孵育30min ，PBS振洗5min（五）  在0.1mol/L三乙醇胺0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ；（六）  滴加預雜交液42,30min；將RNA探針用預雜交液稀釋（1ng/L2ng/L）（七）  雜交、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加2050L的雜交液到組織芯片TMA上，4244濕盒中過夜。、在4×SSC中37洗滌15min 、2×SSC，加入RNA酶（大致為10g/ml）37中洗滌30min，、0.5×SSC,37洗滌15min（八）封閉、1%正常山羊血清孵育30min 、用抗體稀釋液

27、稀釋堿磷酶標記的抗地高辛抗體（1：500）37中孵育3h，PBS洗三次，每次5min、TSM1洗；、TSM2洗；（九）顯色：用TSM2將NBT/BCIP按2：1稀釋進行顯色；顯微鏡下掌握染色程度（十）終止顯色：用水終止（十一）脫水，透明，封固、85%乙醇脫水，2min、95%乙醇脫水5min、無水乙醇脫水15min、二甲苯20min 、封片，鏡檢原位雜交組織化學技術的基本方法點擊次數：236 發布時間：2010-2-1 8:13:09 一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出

28、現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點雜交法（Dot blot）、Souther

29、n印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學技術和原位雜交免疫細胞化學技術。液相分子雜交技術包括吸附雜交、發光液相雜交、液相夾心雜交和復性速率液相分子雜交等。二、原位雜交組織化學技術的由來及發展原位雜交組織（或細胞）化學技術簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術。菌落雜交系細菌裂解釋放出DNA，然后進行雜交。Southern印跡雜交法是

30、以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，Buongiorno Nardelli和Amaldi, John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創造了原位雜交細胞或組織化學技術。Orth（1970）應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜

31、交檢測了病毒DNA在細胞中的定位，但當時的工作多采用冰凍組織切片或培養細胞，探針均采用同位素標記。由于同位素標記探針具有放射性既污染環境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學工作者們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。Bauman（1981）等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應用不夠普遍。 Pezzella（1

32、987）創建了用磺基化DNA探針來做細胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結合的單克隆抗體，從而對雜交結合的探針進行定位。本法的優點是磺基化DAN探針標記簡便，不需作缺口平移標記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標記探針技術建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標記探針技術是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統顯示病毒DNA在細胞中的定位。生物素標記探針技術目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中

33、。這種生物素標記技術又叫酶促生物素標記技術。另一種叫光促生物素標記核酸技術，該技術是用光敏生物素（Photobiotin）標記核酸。目前應用的光敏生物素有乙酸鹽和補骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團、連結臂和生物素（圖20-1）。在強光下，不需酶反應，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結合。光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每100150個堿基才能標記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記數過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。近年來，地高辛（Digoxigonin）標記技術引起科技工作者的極大興趣。B

34、oeringer Mannhem Biochemisca于1987年將地高辛標記的有關試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統安全，方便、省時間。同時在敏感性和質量控制方面比生物素標記技術要優越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色（標記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統），有較好的反差背景。核酸探針根據標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據探針的核酸性質不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA

35、（Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章）。早期應用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經逆轉錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導的DNA聚合酶催化產生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉錄。CDNA是指互補于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA片段插入含有相當的RNA聚合酶啟動子的轉錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟

36、動子在多克隆位點的各側。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應極高。有報告認為其雜交率高于DNA探針的8倍。 DNA合成儀的誕生使制造寡核苷

37、酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。原位雜交組織化學技術在近20年的發展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學研究提供的探針大量增加，探針生產的可靠性和速率大大發展了，更重要的是非放射性標記物的發展使原位雜交組織化學技術在不久的將來將和現今的免疫細胞化學技術一樣成為實驗室的常規技術和臨床日常應用的診斷技術。新的非放射性標記技術正在繼續不斷涌現。 Coulton（1991）建議將非放射性標記技術更名為親

38、合復合物標記技術（Affinity Complex Labelled Probes, ACLP ）。因為“非（ non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據非放射性標記技術的原理是將一個標記物利用其親合性，應用直接或間接的方法結合在核苷酸分子上。原位雜交組織化學技術在生命科學的研究中可視為一項革命性的技術。它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發育生物學。我們在下節將詳加敘述。三、位雜交組織化學技術的基本方法如前所述，由于核酸探針的種類和標記物的不同，在具體應用的技術方法上也各有差異，但其

39、基本方法和應用原則大致相同。大致可分為：雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。a）            固定原位雜交組織化學技術（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。DNA是

40、比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouins固定劑也能獲得較滿意

41、的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70。如冰箱溫度恒定，在-70可保存數月之久不會影響雜交結果。在病理學活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽

42、固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優缺點，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態結構，但由于和蛋白質產生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。b）           玻片和組織切片的處理1玻片的處理玻片包括蓋片和載片應用熱肥皂刷

43、洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。2增強組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據應用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組

44、織由于其與蛋白質產生廣泛的交叉連接就需要應用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結構的形態，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。蛋白酶K（ Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應用于蛋白消化的關鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應用酶K1g/ml（于0.

45、1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中）,37孵育1520min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報告應用胃蛋白酶（Pepsin）20100g/ml（用0.1N HCl 配）37、30min進行消化，所獲實驗結果優于蛋白酶K。不少實驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhyd

46、ride）和三乙醇胺（triethanolamine）中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預熱37的50%甲酰胺/2×SSC液中預雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/L NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學者卻對此持有異議，根據他們的實驗和經驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。3減低背景染色和免疫細胞化學染色一樣ISHH實驗程序中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是

47、諸多因素構成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20g/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內源性的RNA酶，減低背景染色。4防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗

48、用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150左右。有條件的國外實驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時，亦可用國內出產的衛生蒸汽消毒鍋（山東新華醫療器材廠生產）。雜交前及雜交時所應用的溶液均需經高壓消毒處理。c）            雜交（Hybridisation）在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接

49、”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環節。雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內向正華等采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片也可獲得滿意的實驗結果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50左右）導致雜交液的蒸發。因此，也有為穩妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優點是清潔無雜質，光滑不會產生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量

50、能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發的作用。在孵育時間較長時，為保證雜交所需的濕潤環境，可將復有硅化蓋玻片進行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿意的實驗結果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環節。1探針的濃度很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度

51、有關。根據國內外實驗工作者的經驗，認為最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結合度為目的。這和我們在免疫細胞化學試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，根據筆者的經驗及所查閱文獻，在原位雜交細胞化學中，探針濃度為0.55.0g/ml（即0.55.0ng/l）。根據Heinz、Hofelt實驗室經驗，對放射性標記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在25ng/l。Conlton認為生物素標記探針，其最佳濃度在0.55ng/l。作者在英皇家研究生院Polak教授實驗室應用于放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/l，而在非放射性標記（生物素或地

52、高辛） cRNA探針濃度為2.5ng/l，放射性標記DNA探針濃度為1.0ng/l。向正華等應用地高辛標記生長抑素cRNA探針獲得滿意結果，其探針濃度為0.5ng/l。必須強調的是，國內外實驗室都證明加雜交液的量要適當，以1020l/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導致高背景染色等不良后果。2探針的長度一般應用于ISHH探針的最佳長度應在50100個堿基之間。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。據報告，長500個堿基的探針，其雜交時間約需20h左右。200500個堿基的探針仍可應用，如超過500個堿基

53、的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數。3雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環節。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡稱Tm）。原位雜交中，多數DNA探針需要的Tm是90，而RNA則需要95。這種高溫對保存組織形態完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規的加入30%50%甲酰胺（formamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，T

54、m值可降低0.72。因此，可用調節鹽濃度的辦法來調節Tm。Tm的計算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關。由于鹽和甲酰胺濃度的調節等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25左右，即比Tm減低25，大約在3060之間，根據探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在3742左右，而DNA探針或細胞內靶核苷酸為DNA的，則必須在8095加熱使其變性，時間515min，（有作用報告在105微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復性，再置入盛有2×SSC的溫盒內，在3742孵育雜交過夜。雜交的

55、時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應時間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應完成時間為24h。但為穩妥起見，一般將雜交反應時間定為1620h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現有文獻報告看無不良結果。當然，雜交反應的時間與核酸探針長度與組織通透性有關，在確定雜交反應時間應予考慮，并經反復實驗確定。有作者主張雜交反應的孵育應在黑暗環境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。4雜交嚴格度（Hybridization stringency）雜交條件的嚴格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全

56、配對雜交體的鑒別程度。錯配對（mismatch）雜交的穩定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。一般來說，低嚴格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm-35至Tm40之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%90%的同源性核苷酸序列被結合，其結果是導致非特異性雜交信號的產生。中嚴格度， Tm -20至Tm-30的范圍。高嚴格度（high stringency）為Tm-10至Tm-15，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才

57、能形成穩定的結合。麥躍行裝用地高辛標記原位雜交技術檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結果發現在嚴格條件下（Tm-12）各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴格條件下（Tm-35），其相差非常明顯（P<0.001）。因為，在嚴格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴格條件下進行，而低嚴格條件則可用于對病毒感染進行篩選。由于原位雜交技術多數是在Tm-25進行的，不屬于高嚴格范圍，無疑會產生非特異性結合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的

58、穩定性，應用cRNA探針進行細胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高1015。實驗證明，cRNA產生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。5硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。甲酰胺的主要作用在上節已提及，在調節雜交反應溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態結構。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩定的作用。d）           雜交后處理（post hybridisation treatment）雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學的實驗程序中，這也是一個重要的環節。特別因為大多數的原位