1、【最新整理，下載后即可編借】基因工程原理教案（二O 二年修訂稿）安徽大學生命科學學院第一章緒論重點：基因工程的概念和內容，基因工程技術在現代生物技術中 的地位和作用。難點：基因工程與遺傳工程的區別。（一）前言生物工程主要有基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程等4個 部分。（二）什么是基因、基因工程應用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結合成一 具有自我復制能力的DNA分子（復制子、重組體），繼而通過 轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再 進行擴增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝或其表達產物。（三）基因工程的主要內容目的基因的制備載體的選擇和制備 DNA分子的體外連接將

2、外源DNA導入宿主細胞目的基因的篩選和鑒定（四）基因工程的歷史及我國開展基因工程的現狀第二章 基因工程的基本操作技術 重點：PCR技術和基因定點誘變技術。包括PCR技術的原理，反向PCR與染色體步移，不對稱PCR與DNA序列測定，PCR 與RAPD, RT-PCR與RNA分析；基因定點誘變的原理，盒式 誘變，寡核昔酸引物誘變和PCR誘變。難點：酶學測序的原理和程序，基因化學合成的原理和程序。（一）凝膠電泳技術在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以 DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態（Polyanions）。將DNA、 RNA放到電場中，它就會由負極一正極移動。瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯

3、酰胺凝膠電泳脈沖場凝膠電泳 RNA電泳（二）細菌轉化技術轉化作用就是一種基因型細胞（感受態細菌）從周圍介質 中吸收來自另一種基因型細胞的DNA,進而使原來細胞的遺傳 基因和遺傳性發生相應變化的現象。提供轉化ONA的菌株叫做供體菌株，而接受轉化DNA的 寄主菌株則稱做受體菌株。常見轉化方法有原生質體轉化法；化學轉化法；電穿孔法（三）核酸雜交技術所依據的原理是，帶有互補的特定核昔酸序列的單鏈dna 或RNA,當它們混合在一起時，其相應的同源區段將會退火形 成雙鏈的結構。 Southern blot ； Northern blotting;斑點印跡雜交和狹線印跡 雜交；菌落原位雜交注意比較核酸分子雜

4、交法的技術路線比較菌落原位雜交斑點雜交Southern 印跡Northern 印跡將核酸固定在膜上T預雜交（消除非特異吸附位點）-加入 核素標記探針進行雜交T漂洗膜（洗去非待異結合探針）T 放射自顯影或顯色反應示蹤（四）DNA序列分析技術（四）DNA測序分析 DNA鏈末端合成終止法：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；該酶能夠用21, 3 雙脫氧核昔三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核昔酸鏈的3L末 端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA, 引物（特異性引物,如T7, T3, M13等）,DNA聚合酶,dA, dT, dG, dC和一種ddNTPo常用

5、Klcnow大片段，無53,外 切酶活性。 Maxam-Gilbert化學修飾法（哈佛大學）：該方法的基本原 理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成 堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產 物，經凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA 片段的核昔酸序列。 DNA 雜交測序法（SBH-Scqucncing by hybridization）:如 果一段較短的ONA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成 完全的雙鏈結構，我們就推測在靶DNA上存在著相應的互補 序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。用一組已知系列 的寡核昔酸短序列做為探針，同某一較長的靶D

6、NA分子雜交, 從而測定其序列。（五）基因的化學合成（六）PCR技術 PCR反應體系的設立 PCR反應程序設計引物設計原理 PCR技術應用(七) 基因定點誘變技術使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發生取代、 插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白 質工程的重要手段。盒式誘變(cqsseu mutagenesis)包括盒式取代誘變和混合寡 核昔酸誘變兩種方式。寡核昔酸引物誘變應用化學合成的含有突變堿基的寡核昔 酸短片投做引物，進行DNA復制，使寡核昔酸引物成為新合 成的DNA子鏈的一個部分 PCR誘變：重組PCR定點誘變、大引物誘變(八) DNA與蛋白質相互作用凝膠阻

7、滯實驗(Gul wtardation assay),又稱DNA遷移率變化 試驗(DNA mobility shift assay, DMSA): DNA 與蛋白質結合后 分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質發 生結合 DNasel印跡試驗(DNasel foot printing)用于檢測與蛋白結 合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一種特殊的蛋白 質因子同特定DNA片段之間的結合區域。甲基化干擾實驗：根據DMS （硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲 基化，而六氫毗唳又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理。 這種技術可以檢測靶DNA中特異G殘基的優先甲基化對于此 后的蛋白質結合作用究

8、竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示 DNA與蛋白質之間相互作用的模式。DMS化學干擾的主要局 限性時，它只能使G殘基甲基化，但仍不愧為足跡實驗的一種 有效的補充手段，可以鑒定足跡區段中DNA與蛋白質相互作 用的精確位置。第三章基因工程的工具酶重點：限制性內切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶的生化特征、 作用原理和應用領域。包括II型限制性內切酶,T4DNA連接酶， 大腸桿菌DNA連接酶，大腸桿菌DNA聚合酶I, Klcnow酶， T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，反轉錄酶，Taq DNA聚合酶， Pfu DNA聚合酶和反轉錄酶。T4多核昔酸激酶、堿性磷酸酶和 末端轉移酶的作用原理和應用領域

9、。難點：切口轉移與核昔酸標記技術（一）限制性內切酶和甲基化酶在DNA雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子，產生 鏈的斷裂。兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不 是彼此直接相對的因此，斷裂的結果形成的DNA片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。（二）DNA連接酶能夠將DNA鏈上彼此相鄰的3 -輕基（OH）和5 -磷酸 基團（-P）,在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二 酯鍵。只能連接切口（nick）,不能連接缺口（爐p）。而且被連接 的DNA鏈必需是雙螺旋DNA分子的一部分。（三）DNA聚合酶1、Kco/iPo I 的特點（1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，

10、 該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5 -3外切 酶活性，大片段具3 -5外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦稱為Klcnow片段）。（2）聚合酶活性5' 3，要求3' -OH引物和模板DNA,其延續性受反應 條件的影響2、Klcnow 片段由大腸桿菌DNA聚合酶經枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產 生出來的大片段分子。仍具有5 一3的聚合酶活性和3 -5' 的外切酶活性，失去了全酶的5 一3外切酶活性。3、T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養物中純化出的一種特殊的DNA 聚合酶，具有5 一>3'的聚合酶活性和3' 5外切酶活性。5 &g

11、t;3聚合酶活性,1500 nt/min,為Poll的兩倍3' 5外切酶活性，可作用于ss DNA和ds DNA,其切除速度分別為40和4000nt/min4、反轉錄酶許多RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，最常用的是來源于鳥 類骨髓母細胞瘤病毒的反轉錄酶（AMV） AMV具有oc鏈和卩鏈；住鏈具有聚合酶活性和RNase H活 性；卩鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5' ->3'脫 氧核酸外切酶活性5、T7DNA聚合酶 1978年，S. Tabor從感染了 T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞 中純化出來的一種聚合酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋

12、 白質，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。基因5蛋白質：具有聚合酶活性和3 -5'外切酶活性； 硫氧還蛋白：增強基因5蛋白質與模板引物的結合力具有5 -3'的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3->5，核酸外切酶活性。(四)DNA和RNA修飾酶1、末端脫氧核昔酸轉移酶與同聚物加尾末端脫氧核昔酸轉移酶(terminal dcoxynucl cotidyl transferase)，從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性 蛋白質，在二甲腫酸緩沖液中，能催化脫氧核昔三磷酸進 行5' -3'方向的聚合作用，逐個地將脫氧核昔酸分子加 到線性DNA分子的3 -OH末端。

13、2、T4多核昔酸激酶由T4噬菌體的psuT基因編碼的一種蛋白質，最初從T4噬菌 體感染的E. coli中分離出來。作用：催化丫-磷酸從ATP分子 轉移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的長短限制。3、來自于大腸桿菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛腸 (calf intestinal alkaline phosphatase CIP),用于脫去DNA (RNA) 5末端的磷酸基團，使5 -P成為 5' -OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5'端同 位素標記或為了避免DNA片段自身連接(或環化)時可進行 脫磷酸反應。(五)

14、核酸外切酶ss DNAdsDNA大腸桿留外切酶I (exo I)大腸桿闘外切son(exom)大腸桿菌外切酶W (exoVD)噬苗體核酸外切酶(0)T7噬菌體基因6核酸外切俾第四章原核生物基因工程的載體重點:大腸桿菌質粒載體，包括pBR322和pUC18/19載體構建 原理和應用領域，藍/白篩選，質粒DNA的制備和純化；入噬菌 體載體，包括Xgtl()/ll和XEMBL3/4載體構建原理和應用領域，X 重組噬菌體的篩選；M13噬菌體載體，M13mpl8/19構建原理和 應用領域，單鏈DNA的制備；粘粒載體pJB8構建原理和應用領 域。難點：入重組DNA的轉移和篩選()質粒質粒是細菌細胞內攜帶的

15、染色體外的ONA分子，是共價閉 合的環狀 DNA 分子(covalent closed circular, DNA cccDNA),大 小在12()()kb,能獨立進行復制。1、氯化艷密度梯度離心 質粒DNA占總DNA的1%2%;在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷 裂成線性片斷，而質粒DNA分子量小，結構緊密仍保持完整 的狀態；染色劑澳化乙錠(EB)能摻入到DNA鏈的堿基中，導致鏈 的解旋；而且形成的EB-DNA復合物中，EB含量越高，密 度會越低。2、堿變性法根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA片斷之間， 在拓撲學上的差異而發展出來的。在pH值12.012.5范圍

16、內時,線性的DNA會被變性而共價 閉合環狀質粒DNA卻不會被變性。通過冷卻或恢復中性pH值使之復性，線性染色體形成網狀結 構，而cccDNA可以準確迅速復性，通過離心去除線性染色 體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質 粒DNA3、質粒載體必須具備的基本條件具有復制起點自我增殖的基本條件，一般具一個復制子。協助維持細胞內含有1()2()個左右的質粒拷貝具有抗菌素抗性理想的質粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。以便為寄主細胞 提供易于檢測的表型性狀做為選擇信號，而且在有關的限制 酶位點上插入外源DNA后形成的質粒有一個選擇標記。具有若干限制酶切單一位點（MCS）;具有較小的分子量和較

17、高的拷貝數。低分子量的質粒易于操 作，克隆外源片斷后（不超過15kb）仍能有效的轉化給受體 細胞同時低分子量的質粒對限制酶具有多重識別位點的幾率 也較低；較高的拷貝數可獲得大量的克隆基因（二）噬菌體載體1、入噬菌體的基因組結構（1） COS位點線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12皿組成的彼此完全互 補的5'突出單鏈注入宿主后，粘性末端互補形成雙鏈區，成為cos位點。2、插入式載體入噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一 般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。3、入替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必要的片段（20 kb）高感染效率（1

18、09轉化株/ug載體DNA,比質粒高10（）倍）替換型噬菌體入是使用最廣泛的載體。4、體外包裝入重組體dna分子的轉染作用由于入噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的75%或超 過1()5%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生 型DNA (48KB)的75%1()5%左右的DN A,要求入載體 DNA和外源DNA長度上限是51kb,必需基因為28kb,外源 極限在23kbo(三) 噬菌粒由質粒載體和單鏈噬菌體載體結合而成的新型的載體系列。具有質粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便 DNA的操作，可在細胞內穩定存在；具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體幫助下，可進 行噬菌體

19、的繁殖，產生單鏈的子代噬菌體。(四) 柯斯質粒載體(Cosmid vector ) cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記入噬菌體用于包裝的cos末端載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體 外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。 但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于 細胞內。（五）單鏈DNA噬菌體載體M13、Fl、fd Ml3是一種含單鏈（+ ） DNA （ssDNA）的絲狀大腸桿菌 噬菌體，其基因組大小為6.4kbo這類載體主要用來獲得大 量的單鏈DNA片投，這種單鏈DNA片段在遺傳學研究 中主要用來測定DNA序列（sangtr雙

20、脫氧法）、基因的定 點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。 M13噬菌體載體的寄主菌：由于M13噬菌體通過F因子編 碼的菌毛進入宿主細胞，故只能用雄性細菌來增殖病毒。注意比較載體的特點：質粒脛m體柯斯廣粒單體克隆DNA大片段+構建基因組文庫+構建DNA文庠+當規的亞克隆化+構建新型的DNA結構+序列分析+單璉探針+外源基因在大腸桿菌中的表達+（六）人工染色體隨著脈沖電泳技術的發展以及基因組研究的日益深入，對可插入 大片段DNA的克隆載體人工染色體的研究取得了迅速的發 展所謂人工染色體是一類能在生物細胞中獨立“穩定存在和 遺傳的人工重組DNA分子”酵母人工染色體載體（yeast artificia

21、l chromosome, YAC, lOOOkb）酵母染色體DNA自主復制順序（ARS）酵母染色體的著絲粒順序（CEN）酵母染色體的端粒順序（TEL）:細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC , 3OOkb ）哺乳類人工染色體（MAC） Pl衍生人工染色體第五章基因的分離、重組和鑒定基因的克隆，實質上包含著待研究的目的基因的分離與鑒定 兩個主要內容，克隆步驟包括四個步驟用于基因克隆的DNA材料的選擇，及DNA分子的片段化外源DNA片段與載體分子的體外連接反應將人工重組的DNA分子導入他們能夠進行正常復制的寄 主細胞的程序對重組體分子的轉化子克

22、隆進行篩選一、基因組DNA的片段化1、利用限制酶片段化基因組DNA(1) 鳥槍法(shotgun approch)(2) 隨機片段法構建基因文庫時，最好采用隨機片段化的辦法制備克隆片段機械 切割法、限制酶局部消化法二、外源DNA片段同載體分子的重組主要依賴于核酸內切酶與連接酶的作用，選擇外源DNA同 載體三、重組子分子導入受體細胞的途徑原核生物的轉化與轉染：常用大腸桿菌K12突變體菌株(喪 失限制體系)四重組子分子的選擇與鑒定1、遺傳檢測法2、物理檢測法3、菌落或噬菌斑雜交篩選法4、免疫化學檢測法5、蛋白質篩選法6、轉譯篩選法第六章基因克隆的策略從生物有機體中克隆某一特定DNA片段(或基因)的

23、實驗程序1、cDNA基因克隆（cDNA文庫）2、基因組DNA克隆（DNA文庫）3、基因定位克隆（一）cDNA libraries 的構建mRNA isolation,衛 unificationCheck thf RNA integrityFractionate and enrich mRNASynthesis of cDNA g MM. Treatment of cDNA endsLigation to vectoF（二）基因組DNA克隆基因文庫（gene libranO :用重組DNA技術將某種生物細胞 的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機地連接在載體上, 然后轉移到適當的宿主細胞中通過細

24、胞增殖而構成各個片 段的克隆。當制備的克隆數目多到可以把某種生物的全部 基因都包含在內的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種 生物的基因文庫。【最新整理，下載后即可編cukarv'otcs prog 基因組I）NA的片段化（物理切割和限制性內切酵）(三) 克隆基因的分離1、應用核酸探針可以將基因文庫或者cDNA文庫轉移至硝酸纖維素膜后， 用特異性的探針同噬菌斑或者菌落進行雜交，可以篩選出 陽性克隆2、應用差別雜交或扣除雜交法差別雜交(differential hybridization ),又稱差別篩選 (differential screening )適用于分離經特殊處理而被誘發表達

25、的 mRNA 的 eDNAo扣除雜交(subtractive hybridization),又叫扣除 cDNA 克隆 (subtractive cDNA cloning)，通過構建扣除文庫得以實現。抑制性扣除雜交：以抑制PCR為基礎的DNA扣除雜交方 法3、應用mRNA差別顯示技術(DDRT-PCR) 一般用20種隨機引物和12種3 -端錨定引物組成的全部 240組引物對PCR擴增后，所產生的大約20 ()()()條條帶， 基本涵蓋了在一定的發育階段某種類型細胞中所表達的全 部的mRNAo4、cDNA差式分析法(RDA)5、表達序列標簽法(ESTs) ESTs (Expressed Sequence tags )是從已建好的 eDNA 庫中 隨機取出一個克隆，從5末端或3'末端對插入的eDNA 片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約6()-5()()bp的一段 eDNA序列。6、基因表達系列分析法(SAGE)分離每個轉錄本的特定位置的較短的單一的序列標簽(約 9-14個堿基對，Sequence Ta