1、臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識近年二代基因測序 （ ， ） 技術快速發展， 其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、 實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產前篩查等。國內外有關學會已出臺相關共識與指南以推動其在臨床中的應用。中華醫學會病理學分會和中國抗癌協會腫瘤病理專委會前期組織病理、臨床、生物信息等專家進行了充分討論，擬在的操作流程、數據處理、結果解讀等方面作規范和建議，以規范在分子病理領域的應用。 臨床分子病理實驗室樣本可采用甲醛固定石蠟包埋組織 （，）、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊、石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。本共識特色是基于病理評估的組織

2、樣本（、新鮮）的規范。測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著重在于目標區域測序（）分析的實踐。隨著技術的更新和應用的成熟，本共識將持續更新以滿足臨床需求。一、 實驗室總體要求 檢測實驗室的總體設計與要求應參考 分子病理診斷實驗室建設指南（試行）、醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工 作導則、個體化醫學檢測質量保證指南 、腫瘤個體化治 療檢測技術指南 、個體化醫學檢測實驗室管理辦法 、測 序技術的個體化醫學檢測應用技術指南（試行） 進行。1 檢測人員的資質要求： 檢測技術人員應具備臨床病理學、 分 子生物學的相關專業大專以上學歷，并經過技術的理論與技能培訓合格。數據分析人員應具有臨床醫學或分子生物學

3、或遺傳學知識背景并經生物信息學培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人（醫學博士學位或高級職稱）審核。2 檢測實驗室的區域設置要求： 原則上實驗室應當有以下分區：樣本前處理區、試劑儲存和準備區、樣本制備區、文庫 制備 區、雜交捕獲區 / 多重區域（第一擴增區） 、文庫擴增區 （第二擴增區） 、文庫檢測與質控區、測序區、數據存貯區。 各工作區空氣及人員流向需要嚴格按照醫療機構臨床基因 擴增檢驗實驗室工作導則 。分區可根據實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應與組織樣本分開。3 檢測試劑及項目要求： 試劑和測序平臺均應選擇中國食品 藥品監督管

4、理總局（）認可產品。涉及到實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規程（） ，需經過臨床實驗室自建項目（）驗證合格才可使用。每個檢測項目在驗證時需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變 ，、小片段插入或者缺失（） 、基因拷 貝數變異 （） 、 染色體結構變異， （） 以及不同的樣本類型 （如組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定的準確性、精確性、 敏感性、 特異性等性能參數進行驗證。 應該有經過標準品測試的在不同的 （）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數據，確定不同樣本的可信的測序深度。經驗證后，發 生的任何改動， 包括試劑、 儀器、 基因項目等都需要重新做驗證

5、。驗證實驗結果簽名留底備案。4 檢測實驗室的質量管理要求： 檢測主要包括實驗操作和生 物信息學分析兩部分。 實驗操作部分包括樣本準備、 文庫制 備、編碼（）、目標區域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（） 、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及 報告等。上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和及機器運行和維護，具有嚴格的室內質控措施；定期參加室間質評以有及持續的質量保證和改進計劃。二、分析樣本、基因和轉運要求分析樣本類型可采用樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本 和血漿 / 血液標本等。 對于腫瘤體細胞變異初次檢測應首選經病理評估的組織樣本，在此數據基礎上的再次檢

6、測可選取液體樣本動態監測。檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質及含量，根據不同 腫瘤類型選擇合適的基因測序。 不同疾病的基因列表，必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。 未經病理評估的基 因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床 診斷目的。樣本質量對檢測結果和分析至關重要， 病理醫師需要對可評 估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死 和不利于核酸檢測的前處理（例如含脫鈣液處理） ，病變細 胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到 20% 以上， 低于此標準可富集后檢測。 檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理指導。對

7、于不同的樣本（、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送，物流環節（含冷鏈運輸）應有相關運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。三、檢測流程中的質量標準1 . 核酸提取及其質量分析：提取的核酸質量是檢測成功的關鍵因素， 在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估， 包 括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類型制定相應的用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。2 . 文庫制備及其質量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫， 無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測， 都應 對檢測基因、 區域或突變熱點進行描述， 并建立實驗室檢測。建立好文庫后上機測序前需

8、對文庫進行質量分析。 每個檢測 項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。3 測序儀上機分析及其質量分析： 建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據檢測樣本量和質量要求確定適當的芯片，以保證測序質量和靶區覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進行測序。產生的測序數據質量參數要求詳見后文。4 檢測中的樣本追蹤及對照設置： （ 1 ）樣本追蹤：為確保檢 測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個位點或其他標簽 作為樣本身份標識（ ），在檢測前對每個樣本進行位點信息 的測定， 在檢測后對上述位點進行追蹤， 證明沒有交叉污染 （ 2 ）陽性對照：應用組合型質控材料，可

9、采用已知突變信 息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以 確保其檢出能力。 （ 3 ） 陰性對照：用無核酸或明確無突變的 樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。（ 4 ）應對方案和替代方法：各個質量控制步驟中 如出現異常或失敗，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質量差或有問題的區域應建立替代方法（如測序）數據的生物信息分析可分為兩個主要步驟：生物信息分析一是對測序數據進行質控分析及過濾。二是對通過質控的序列進行變異位點鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，都要通過適量標準品測序數據進行驗證，證明所用軟件床報告的要求。及參數可達到臨1 生物信息分析

10、流程標準： （ 1 ）質控分析：為保證分析結 果 的可靠性，需要對原始的測序數據進行質量控制與過濾。測 序數據的質量控制主要包含4 個方面：質量評估、去接頭序 列、去低質量序列、去重復序列。2）序列比對（）將通 過質控后每一條與參考基因組進行比對，回貼到基因組上最 佳位置。（ 3 ）變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤 測序中， 主要檢測和兩種突變類型， 參數調整后可分析。部 分的設計還可以鑒定染色體易位。 對于腫瘤基因測序數據，鑒定后的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認， 如（）（ 4 ）變異注釋：基于通用數據庫，對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。2 生物信息分析流程質量管理：

11、 實驗室應建立生物信息學程 序的書面質量管理（） 計劃文件。必須包含每次運行時監 測和評估運行性能的指標和質控參數， 以及定期 （例如每月、 每季度）監測的指標和質控參數。指標和質控參數可包括但不限于標準品的突變類型及百分比。 生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標準品進行驗證，驗證其特異性和靈敏度是否達到實驗室要求。驗證結果簽名留底備案。（ 1 ）數據存儲：實驗室需要在生物信息分析過程 中對原始數據及最后的結果數據進行標準化存儲，并要保存相應的年限以備查。 （ 2 ）版本可追溯性：每份病例數據分析 報告中，生物信息數據分析流程所涉及軟件、算法、參數及 數據庫的版本必須可溯

12、源。 （ 3 ） 異常記錄。實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離生物信息分析標準分析流 程的檢測。3 生物信息分析質量指標： 原始文件及比對結果文件的質量 指標見表 1 。表 14 數據存儲格式標準：為了規范和管理各類數據，各個 實驗室需按照編號進行數據管理，所有數據按照國際標準格式進行存儲。 必須建立本地變異數據庫 （用于檢驗變異真實 性） 。5 數據存儲傳輸及共享安全標準： 實驗室需要制定規章制度以確認測序數據在內部及外部存儲及傳輸過程中的安全性 和機密性。正常人群的變異數據應該共享。五、結果解釋及報告1 臨床報告包含內容：基于高通量測序技術，臨床實驗室比 較容易的獲取更高通量的臨

13、床樣本檢測數據，不可避免會檢測到意義未知的變異位點， 在實際工作中會有一定的不確定性。但的檢測報告建議體現以下內容：（ 1 ）檢測名稱，如基因變異檢測報告。（ 2 ）患者基本信息，姓名，年齡，性別，住院號，送樣醫 院科室及醫師等。（ 3 ）樣本信息，病理號，取材部位，樣本類型（、新鮮、血液等）、送檢日期、報告日期等。（ 4 ）病理信息，腫瘤組織類型、位置、分期、細胞含量、腫 瘤細胞比例、特殊說明（出血、壞死、酸脫鈣處理等）（ 5 ）檢測技術，包含所用基因、檢測平臺名稱，分析軟件版本號等。（ 6 ）結果列表應包含，基因名稱、變異在染色體位置、變異頻率、的號（開頭）及符合人類基因組變異協會（ ）

14、書寫規范的突變類型、編碼蛋白號（開頭）及突變類型、雜合/ 純合狀態等。（ 7 ）臨床意義解讀和批注：體細胞突變，報告各個腫瘤檢測到的變異位點及臨床意義。胚系突變，對于檢測到的變異位點的致病性予以相應的臨床解釋。臨床意義解讀要客觀平實的描述，在疾病相關性只描述既往研究中的療效或預測，不能出現使用何種治療手段或策略的語言。（ 8 ）若檢測失敗，應闡述失敗原因。（ 9 ） 最終報告應由檢測者、 報告醫師或指定審核人聯合簽發。2. 基因變異的命名： 在描述所檢測出的基因變異時要遵循一 定的原則和規范， 推薦使用人類基因組變異協會命名指南（ ） 。對于遺傳病相關基因變異命名， 推薦美國醫學遺傳學 學院

15、（ ； ）的遺傳疾病變異分類指導的命名、遺傳背景 說明以及權威文獻說明。3. 臨床意義的解讀和批注： 對于腫瘤體細胞突變， 根據突變 的 類型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方A 級：美國食品藥品管理局（）或中國食品藥品管理局（）準的用藥治療靶點；寫入中外診療指南有明確診斷/治療/預后意義的變異。在報告注釋該變異位點的臨床診斷/治療/預后意義的權威指南來源。B 級： 尚未進入診療指南， 但已經寫入該領域的專家共識的 變異位點。注釋時要批注研究報道及專家共識的來源，明確 其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態等信息。C 級： 或批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異， 或者正 在進行中的臨床試驗變異位點。注釋時要批注用于其他腫瘤的權威指南，研究文獻及臨床試驗正在開展的狀態等信息。D 級： 處于學術爭議或臨床意義不明確的基因變異。 同一實 驗室應該有統一的政策用來應對檢測過程中出現的臨床意義不明變異情況。對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測的結果，在病理報告中不能出現建議使用何種治療手段或策略的語言。對于遺傳疾病（ ）檢測，除了中外診療指南及重要參考文 獻以外，推薦兩個數據庫： （）和美國醫學遺傳學學 院（）的遺傳疾病變異分類指導注釋臨