1、免疫學技術的迅速發展對精度的要求越來越高，一般的酶免檢測技術已逐漸無法適應這種形勢的需要。現今發展的主流已不再是用放射性同位素標記的測定方法(避免污染環境及對人體損害)，而是轉向于能在任何地方操作的快速均相和固相測定，最終趨向于能夠槍測到皮克或10負18摩爾級的、非同位素的、自動或半自動的實驗室測定技術，發光免疫分析技術順應了這一潮流，開創了免疫診斷的新紀元。 發光免疫分析是一種靈敏度高、特異性強、檢測快速及無放射危害的分析技術。70年代末以來得到了迅速發展，目前在國際上已經實現商品化和產業化的發光免疫分析產品，基本上可以分為：化學發光、時間分辨熒光(也稱時間延遲光致發光)、電化學發光(也稱場

2、致發光和電致發光)幾種。 1、化學發光 化學發光是指在化學反應過程中發出可見光的現象。通常是指有些化合物不經紫外光或可見光照射，通過吸收化學能(主要為氧化還原反應)，從基態激發至激發態。退激時通過躍遷(或將激發能轉移至受體分子上)，釋放能量產生光子，以光形式放出能量從而導致的發光現象。其主要特點為消耗發光劑。同時量子效率相對較低。 1.1 按化學反應類型分類：可分為酶促化學發光和非酶促化學發光兩類。其中酶促化學發光主要包括辣根過氧化物酶(HRP)系統、堿性磷酸酶 (ALP)系統、黃嘌呤氧化酶系統等。酶促發光的共同特點為發光過程中作為標記物的酶基本不被消耗，而反應體系中發光劑充分過最，因此發光信

3、號強而穩定，且發光時間較長。因此可采用速率法測量，故檢測方式簡單、成本較低。酶促反應的主要缺點為工作曲線可能隨時間漂移，而且低端斜率容易呈非線性下移。而非酶促化學發光包括吖啶酯系統、草酸酯系統、三價鐵一魯米諾系統等。非酶促發光的共同特點為發光過程中標記物被消耗，同時作為標記物的發光劑是發光反應的瓶頸，即含量總是相對不足，因此發光信號持續時間較短；如果直接在免疫反應杯中啟動發光反應，由于發光劑被很快消耗，故只能進行一次性測量。所以重復性較差。為降低檢測成本并實現重復測量，目前普遍采用原位進樣加流動池的時間積分測量方式。因此儀器成本及維護費用較高，而且反復使用的流動池可能導致交叉污染；并目沖洗或進

4、樣中產生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會成為提高檢測效率的瓶頸。另外，使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。 1.2 按發光持續時間分類：可分為閃光和輝光兩類，閃光型發光時間在數秒內，如吖啶酯系統。其檢測方式一般采用原位進樣和時間積分法測量，即在檢測器部位加裝進樣器，并保證加入發光劑和檢測2個過程同步進行；同時以整個發光信號峰的面積為發光強度。而輝光型發光時間在數分鐘至數十分鐘以上，如HRP一魯米諾系統、ALPAMPPD系統、黃嘌呤氧化酶-魯米諾系統等。其信號檢測無需原位進樣，一般以速率法測量，即在發光信號相對穩定的區域任意點測量單位時間的發光強度。 測量化學

5、發光反應的光強度，求得某些化學物質和生物物質的含量，尤其與免疫學方法結合以后形成的化學發光免疫測定法(CLIA)，其既具有發光檢測的高度靈敏性，又具有免疫分析的高度特異性，檢測快速，試劑無放射危害，檢測限達10負15 molL。 1.3 評價：化學發光標記物已廣泛應用于抗原、半抗原和抗體的檢測，與放射性核素標記物相比較，它的優點在于安全(無放射危害)、穩定、測量快速、靈敏度高、線性范圍寬、自動化程度高、減少了人為的誤差。檢測快速縮短了等待結果的時間，無需批量檢測可隨到隨測保證及時提供結果。缺點在于一般化學發光是標記催化酶或化學發光分子的發光反應，一般發光不穩定，為問斷的、閃爍性發光，而且在反應

6、過程中易發生裂變，導致反應結果不穩定。此外。檢測時需對結合相、游離相進行分離，操作步驟多，測試成本高。主要問題是化學發光的產生通常是瞬間完成的，發光的峰值很快衰減，再是本底較高和干擾妨礙應用。 1.4 代表儀器 1.4.1 美國拜耳公司最新診斷產品ACS：180系列全自動化學發光免疫分析系統，以吖啶酯作為標記，量度AE標記物化學反應所產生的光量為基礎，靈敏度可達10負15 gmL。 1.4.2 美國雅培公司生產的AxSYM系列全自動免疫發光分析儀將3種技術于一機，可用于非均相標記微粒子酶免發光分析(MEIA)、離子捕捉發光分析(ICIA)和均相標記熒光偏振免疫發光技術(FPIA)，目前已有80

7、多個檢測項目可供臨床應用。1.4.3 美國貝克曼庫爾特公司AccessOR全自動微粒子化學發光免疫分析系統。采用ALP-AMPPD發光系統，以微粒子作為載體，表面積大、結合快、達到最大發光信號時間短、反應及分離速度快，縮短了分析時間，有效提高了靈敏度和準確性。該系統可全自動控制整個測定和數據分析處理，具有批量和任選測定24個項目的能力和急診插入功能，平均檢測速度100/h。冷藏試劑盤可放24種試劑，探針直接插入試劑盒并自動封閉，直至試劑用完，不污染不浪費。超聲波技術被用于攪拌使微粒懸液混均勻并加速反應，用于探針取樣液面檢查保證取樣準確，用于洗滌時減少交叉污染。使用AccessOR的用戶還可以申

8、請Internet全球通訊網絡，進行通訊查詢。AccessOR獨特的塑料智能化外形設計，使其從外觀到內在品質，給人們留下深刻的印象。 1.4.4 美國DPC公司全自動化學發光免疫分析儀IMMULlTE，以ALP為標記物，以金剛烷作發光底物，測定靈敏度相當于10負21molml的酶，采用聚苯乙烯珠作載體，其檢測水平已能達到10負12gml。目前能夠檢測性腺類、甲狀腺功能類、腫瘤標記物類、傳染病類、細胞因子類、血液病類、糖尿病類、腎上腺功能類、治療藥物類、成癮藥物類、短肽及其他分析物類，還能提供象肌鈣蛋白(TNI)這類急診項目的快速診斷試劑盒。 2、電化學發光分轎 2.1 電化學發光 2.1.1

9、電化學發光的原理是對電極施加一定的電壓進行電化學反應，反應的產物之間或與體系中某種組分發生化學發光，用普通光學手段測髓發光光譜軍強度從而對物質進行衡量分析的一種方法。與化學發光有所不同，其差異在予氧化反應是通過電極上的電化學反應產生的，而不是氧化劑或發光劑自身內氧化產生，其標記物為三聯吡啶釕及其衍生物Ru(bpy)3 2+，并以三丙胺(TPA)為還原荊。如圖1所示，Ru(bpy)32十穰TPA分剃在弼投裊囂氧化成Ru(bpy)3 3+搬TPA的陽離子自由基IPA+，IPA+迅速脫去一個質子形成TPA自由基，TPA具有強的還原性，從而把Ru(bpy)3 3+還原為激發態的Ru(bpy)3 2+，

10、后者發射一個620 nm的光子回到基態再參與下一次電化學發光。必需0.01毫秒就可發出穩定的光，每毫秒幾十萬次的循環電化學發光，大大提高了分析的靈敏度。另外，通過電極反應在線制備了不穩定的發光劑Ru(bpy)32+TPA，避免了直接使用Ru(bpy)3 2+對分析測試的影響。 2.1.2 電純學發光的主要特點是發光過程中的標記物基本不被消耗，麗反應體系中其他成分充分過量，因此發光倍號強而穩定，且發光時間較長。其缺點為測量方式復雜、儀器成本及維護費用高；同時環境及樣品中同類元素也存在較弱的本底干擾。反復使用的流動池可能導致交叉污染；而沖洗或進樣中產生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會

11、成為提高檢測效率的瓶頸。另外使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。 2.2 免疫電化學發光分析：集電化學發光、生物素一抗生物索、免疫分析和由固相免疫分析發展起來的磁微球等技術于一體，是眾多學科交叉的研究領域。 免疫學的核心問題是抗原一抗體的特異性結合，主要采用固相的方法，即將抗原或抗體固定到磁微球上，經免疫反應后，在固相載體磁微球上形成抗原一抗體復合物，外加磁場沉降這種復合物，然后洗滌除去多余或游離的抗體或抗原，然后進行電化學發光測定。與一般免疫反應類似，可分為直接法、雙抗體夾心法和競爭法。 2.3 免疫毫純學發光鶼瘟曩毫純學發光綜合了光學、電子學、生物學、免疫學和計算機，

12、禚臨床中可糟予以下幾個方面。 (1) 蛋白質和激素測定：電化學發光技術在激素的測定中有替代放射免疫的趨勢。可檢測甲狀腺激素、促甲狀腺激索、性激素、雌二醇、促卵泡激索、促黃體激索、人絨毛膜促性腺激素、胰島素、胰島素樣生長因子、甲狀腺降鈣素、腫癌標志物、前列腺特異性抗原、肌鈣蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、腫瘤壞死因子、r干擾素、人體腫瘤相關糖蛋白、自細胞介素系列等。 2.3.1 毒素與病毒抗原分析：如肉毒桿菌毒索、蓖麻蛋翻、霍亂亞基和葡萄球菌腸毒素等，檢測限達10-15g。還有炭疽桿菌芽孢、傷寒沙門菌、鼠疫抗原等沙門菌和。O一157病毒等。 2.3.2 DNARNA核酸序列分析：在核酸分析中利用電化學

13、發光技術將Ru(bpy)3+標記引物或探針進行DNA雜交分析或聚合酶鏈反應，是實驗室定量分析標 本中核酸含量的一種有發展前景的檢測方法。該技術述可用于檢測乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等其他致病性病毒和病原微生物。 2.3.3 其它物質的檢測：還可對其他一些微量物質進行測定，如維生索、葉酸、免疫球蛋白及酶類，人免疫球蛋白、人血清清蛋白、人中性粒細胞溶菌酶、葡萄糖和除草荊等。 2.4 評價：電化學發光是一種電促發光技術，采用的是特殊的化學發光劑Ru(bpy)3+作為標記物并在發光反應中循環使用，既避免了同位素的半衰期短及放射蝕危害，又克服了酶標記的不穩定性，而標記物很穩定，在室溫下半衰期大于1年

14、；同時還結合了90年代初期問世的鏈霉親和素的新型固相技術，不但使檢測的融敏度大大提高，而且還可自動分離游離相和結合相，使檢測更易實現自動化。電化學發光的反應時間僅為20 min，而且標準曲線儲存在條碼中，每次測定只需一點標定，Ru(bpy)3+的穩定性很好，在室溫下半衰期長達1年。這些優點決定了操作的快速、簡捷，無需經常校正。 因此該技本與其它的分析手段比較，在免疫學檢測中有顯著的優勢。它的優點除了靈敏度高、特異性強、檢測快速外，更為可取的是所用試劑毒性低，無放射性危害，并且有良好的穩定性。以最易受影響的促甲狀腺素為例，353周后，電化學發光試劑仍然穩定。電化學發光分析方法多樣，適用面較大，廣

15、泛地應用于抗原、半抗原和抗體的免疫梭測。其線性范圍也較寬，符合臨床檢驗的需要。耐它與普通的化學發光比較，前者為電促發光，在電極表面通過三角形脈沖電壓的激發產 生穩定、連續、高效的發光，后者則是標記辣根過氧化物酶作用下催化化學發光劑(如魯米諾、吖啶酯等產生不穩定、間斷、閃爍性的發光)，基反應過攘中容易發 像裂變恧使結果不穩定。電億學發光測定的照光度裰據釋放光子的波長仍屬熒光測定酶范疇，但與直接的熒光發光不同，熒光發光的靈敏度受熒光發光的本底和光學部件散射光的影響，適應范圍也較低。 電化學發光技術的發展趨向在于合成新的發光標記物、優化標記技術和免疫分析方法，從而追蹤生命科學發展的前沿領域，建立對生

16、命過程有重要意義的內源性和外源性物質的分析方法。 2.5 代表儀器：目前生產電化學發光儀的廠家較少，主要生產廠家是瑞士羅氏診斷公司，與德國BoehringerMannheim寶靈曼公司公司合 作，Elecsysl0lO20lO，ROCHE 2010系列全自動電化學發光免疫分析儀(ORIGEN分析儀)。標本可隨時插入常規操作中并優先測試，也為臨床急診測定提供了方便。 3、時間分辨熒光 3.1 時間分辨熒光免疫分析(TR-FIA)TR-FIA是將三價稀土鑭系離子銪(Eu)，釤(Sin)等通過絡合物標記到抗原或抗體分子上，并通過檢測其熒光實現免疫分析。由于稀土離子熒光的激發光波長范圍較寬，而發射光波

17、長范圍較窄，而且激發光和發射光之間的波長差距較大，特別是熒光壽命大大長于常規熒光。因此它采用了與常規熒光免疫不同的檢測方式，即通過脈沖激光器間歇激發樣品，同時檢測器在其激發的間隙測定特定波長的熒光強度。這樣不僅消除了雜散光的干擾，而且也大大減弱了樣品及反應杯中雜質所產生的背景熒光干擾。所以其檢測靈敏度和線性范圍大大高于常規熒光。 3.2 解離增強時間分辨熒光免疫分析法(DELFIA) 由于稀土離子在水相中的熒光效率很低，因此需要將其包裹在一個非水相的環境中才能檢測到理想的熒光強度。最常見的做法是在檢測前先用酸將稀土離子從標記抗原或抗體七解離出來，由一系列表面活性劑構成的微囊吸收并包裹稀土離子，

18、這種方式稱為DELFIA，其中的酸和表面活性劑等被稱為增強劑。迄今為止，在所有的時間分辨熒光免疫分析法中，這種方法的靈敏度是最高的，因此近年來得到了廣泛應用，已經成為目前最常見的時間分辨免疫分析技術。 3.3 直接時間分辨熒光測囂法由于該方法需要在常規免疫分析中的洗滌步驟后還要進行熒光素的解離和增強操作，因此分析步驟有些冗長繁瑣。時間分辨熒光免疫分析最大的不足是環境及樣品中同類元素導致的本底干擾。作為稀土資源大國的中國，這一點尤其不容忽視，特別對北方地區更為重要。雖然可以通過實驗用水和實驗室環境的特殊凈化杜絕一部分干擾，但會帶來運行成本的提高；況且由于患者體內這類元素的積累而造成的臨床標本污染

19、根本無法消除。因此人們研究開發了另一種稱為直接時間分辨熒光測量法的技術，也有人稱之為后標記技術。它首先使用一種不含稀土元素的特殊絡合物標記抗原或抗體，等常規免疫分析中的洗滌完成后，再加入稀土元素并進行測定，這樣就基本掩蔽了同類元素導致的本底干擾。但其靈敏度較低，目前還不能與上述兩種方法相抗衡。除上述方法外，還有一種固 相時間分辨熒光法，它是使用一種特殊的絡合物將三價稀土離子標記到抗原或抗體分子上，同時該絡合物還可以維持三價稀土離子周圍的非水相環境，因此也充當了增強劑的角色。該方法的特點是無需增強劑，故操作簡單，但靈敏度度低于上述DELFIA。 3.4 評價時間分辨熒光技術的不足為測量方式復雜、

20、儀器成本及維護費用高，環境及樣品中同類元素可導致本底干擾等。 3.5 代表儀器法國CIS公司1996年在歐洲推出KRYPTOR全自動時間分辨熒光免疫分析系統，用三價鑭系元素銪(Eu3+)與磷酸三丁酯劑量 校準曲線。近年來，該系統已可供臨床實驗室應用的試劑盒有腫瘤標志物、唐氏癥篩查指標、性功能激素檢查、心血管疾病、骨代謝、甲狀腺自身免疫性疾病等。TRFlA可做雙標記和多標記分析，美國PE公司的1420Victor多標記免疫分析系統集時間分辨免疫熒光分析、化學發光免疫分析、熒光分析及酶聯免疫吸附分析于一機，實現一次反應多項結果，1臺儀器多種功能。 4、生物發光 4.1 生物發光是生物體內發光蛋白通

21、過消耗能量物質而產生的發光現象，其特點為只消耗能量物質，不消耗發光物質。近年來，隨著越來越多的發光蛋白被提純、其編碼基因序列被測定、表達，其發光底物被人工合成，相關的基礎研究和產品的商業化進展迅速。已經發現的發光蛋白包括細菌熒光素酶、蟲熒光素酶、腰鞭毛蟲、熒光索酶水母素及奧貝林綠色熒光蛋白等，類似的熒光蛋白還有橙色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍綠熒光蛋白等。另外，目前己經被發現的生物發光底物有：蟲熒光素、腔腸素、還原型黃素單核苷酸、腰鞭毛蟲熒光素、種蝦索等。 4.2 生物發光免疫分析法是采用生物發光物質，如蟲熒光素酶或細菌熒光素酶或者轉助因子(NAD+、三磷酸腺苷等)進行標記抗原抗體，使其直接或間接發光反應進行檢測。如Wannlund等在1980、1982年用熒光素酶進行標記，發光免疫分析測定氨甲蝶呤和細菌熒光素酶，Terouanne在1986年采用6一磷酸葡萄糖脫氨酶標記孕酮進行發光免疫分析血清中孕酮。 4.3 生物發光免疫分析法在生物醫學領域內的應用主要包括細胞學、分子生物學、衛生學、生物傳感器、脂質過氧化檢測和藥物篩選等6個方面。其中細胞學檢測主要是利用細胞內ATP導致的蟲熒光索酶生物發光進行活細胞計數，目前已實現快速、動態，單細胞分析。近年來，在該領域內的應