1、 畢業設計(論文)開題報告學 生 姓 名：學 號：專 業：設計(論文)題目：產桿菌肽鋅微生物的育種指 導 教 師:2016年2月29日 畢 業 設 計（論 文）開 題 報 告1結合畢業設計（論文）課題情況，根據所查閱的文獻資料，每人撰寫2000字左右的文獻綜述文 獻 綜 述1 引言  桿菌肽是 1943年由美國哥倫比亞大學的Johnson 在從患者Tracy創傷中分離出的枯草桿菌（bacillus sabtilis）中發現的1。在隨后的研究中，人們發現了桿菌肽許多優良的特性，使它在獸藥、動物飼料添加劑和人醫臨床等方面得到了廣泛的應用。桿菌肽是類白色至淡黃色的粉末，無嗅、味苦，有吸濕性

2、，易被氧化劑破壞，在溶液中能被多種重金屬鹽類沉淀。桿菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。桿菌肽本身可抑制、殺滅某些致病菌,當它與Zn²+絡合時,其抗菌活性會得到一定程度的增強,從而對革蘭氏陽性病原菌,如葡萄球菌、溶血性鏈球菌、微型球菌、藤黃八疊球菌、非溶血性鏈球菌、魏氏梭菌、放線菌以及部分革蘭氏陰性菌均產生較強的抑制作用,抗菌譜與青霉素類似2。桿菌肽的作用機理是由于它是類脂質焦磷酸的特異性抑制劑,能抑制細胞壁所合成的脫磷化過程,影響磷脂載體的轉運及向細胞壁支架輸送粘膚,從而抑制細胞壁的合成另一方面是與敏感菌的細胞膜結合,損傷細胞膜,使細胞膜的通透性增加導致內粘

3、質外流其次是干擾敏感菌細胞內原漿蛋白的合成3。2 桿菌肽的研究進展 桿菌肽是目前國內外廣泛用于飼料中的一種新型的理想廣譜抗菌素，它能夠有效抑制 G+ 和 G- 細菌,如金黃色葡萄球菌、鏈球菌等，具有抗菌譜廣、排泄快、畜禽吸收量少、安全性評估良好、不產生耐藥性等很多優良特性，是飼料添加劑中傳統抗生素的有效替代品，已被應用于生物表面活性劑、飼料添加劑、食品防腐劑和作為生物學的研究工具4。目前桿菌肽的工業生產主要通過微生物發酵法制得,地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是目前廣泛應用的工業生產菌種。桿菌肽的發酵生產過程國外報道較多，國內相關報道不多，且發酵水平不高。我國的桿菌

4、肽發酵生產始于 20 世紀 60 年代，1967 年華北制藥廠首先在國內生產桿菌肽。隨著我國畜牧養殖業的興起，桿菌肽于上個世紀90 年代開始大量生產，以芽孢桿菌為菌種，玉米和豆粕為主要原料，通過生物發酵、鋅絡合制備而成5。我國天津新星獸藥廠選育獲得的高產菌株,生產能力為 700g/ m L, 與國外報道 1200g/ m L 的水平相差還是很多。國內桿菌肽發酵工業的生產水平亟待提高.過去，由于在人畜共用抗生素的使用方面管理不嚴格，造成了交叉耐藥菌的發生率快速上升。因此，近年來國際上加強了這方面管理，出臺了“人畜共用抗生素在使用上必須相分離”的指導原則，使得桿菌肽成為當今世界銷售量最多的飼料添加

5、專用抗生素之一6。隨著我國經濟的迅速發展和科學技術的不斷提高，養殖業的發展腳步也逐漸加快，桿菌肽產品作為多肽類抗生素的一種，對于提高飼料利用率、促進動物生長起著重要作用，在動物養殖中得到廣泛應用。因此，要認識到桿菌肽產品的重要作用，充分了解其特性，并且把握其發展前景，合理利用桿菌肽鋅和亞甲基水楊酸桿菌肽，促進養殖業的進一步發展。3 桿菌肽測定的方法 桿菌肽（鋅）的檢測在實際應用中，Mariko Matsumoto 等曾用 ELISA 法測定雞血中桿菌肽的殘留量，即用辣根過氧化物酶為酶標記物，用桿菌肽抗體 Ig G 測試條進行檢測。 該法簡便快速，檢測底限為 1 ng/m L，回收率范圍為 97

6、 %103 %。 Williams 等通過 ELISA 技術分析了動物飼料中桿菌肽（鋅）各組分與抗體的反應情況，以此來監測桿菌肽（鋅）在貯藏過程中的穩定性。 Wan 等建立了一種 HPLC-MS/MS 法測定牛奶和動物組織中的桿菌肽 A、黏菌素 A和黏菌素 B 的方法。該方法準確、靈敏，適用于食品中多肽類抗生素的快速篩選和定量檢測。 目前，我國官方頒布的檢測方法有進出口商品檢驗局發布的 出口禽肉中桿菌肽殘留量檢驗方法杯碟法（SN 0295-93）、農業部 2004 年發布的 飼料中桿菌肽（鋅）的測定高效液相色譜法（NY/T 726-200）和國家質檢總局（SBTS）2006 年發布的豬肉、豬肝

7、和豬腎中桿菌肽殘留量的測定液相色譜串聯質譜法 （GB/T 20743-2006）。2007 年中華人民共和國農業部公告第 824 號，確認了國家獸藥殘留基準實驗室藥物檢測范圍。3.1桿菌肽效價的測定方法 測定桿菌肽效價的國際常用方法是管碟法, 特別對金黃色葡萄球菌和鏈球菌屬具殺菌作用。 是利用抗生素在特定實驗菌的瓊脂培養基內的擴散作用 , 形成一定濃度的含抗生素的球型區, 抑制了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈, 將已知效價的標準溶液和未知效價的供試品溶液在相同條件下進行培養, 比較兩者的抑菌圈的大小, 利用各種不同的計算原理 , 就可以準確地測定出供試品的效價。 3.2桿菌肽含量的測定方法取

8、固體培養好的地衣芽孢桿菌，無菌操作調取菌體接入發酵培養基，37恒溫搖床（轉速249r/min）培養24h，所得的地衣芽孢桿菌發酵液以10000r/min轉速離心，取上清液即得到桿菌肽粗提液。取1.00ml粗提液經0.22m濾膜過濾后保存，濾液用于高效液相色譜法檢測桿菌肽的含量。4 桿菌肽的結構桿菌肽屬次級代謝產物，初級代謝貫穿于生命活動的始終,與菌體生長水平平行進行。而次級代謝一般只在菌體對數生長后期或穩定生長期進行。因此,此類微生物的生長和次級代謝過程可以劃分為兩個階段,即菌體生長階段和代謝產物合成階段。桿菌肽在合成階段形成的次級代謝途徑7。桿菌肽的結構是由個氨基酸組成含有曝哇環的多肽復合體

9、,它有許多異構物,分別為桿菌肽A、B1、B2、B3、D1、D2、D3和E。其中A組分分子式為C66H103N17O16S,在所有的異構體中,其活性最高,含量也最為豐富見圖1-3。85 桿菌肽的發酵調控桿菌肽是由地衣芽抱桿菌或枯草芽抱桿菌代謝產生的一類多肽類抗生素。氨基酸在其生物合成過程中有及其重要的作用。它們是Ba合成的直接前體,也可能作為Ba合成酶的誘導物,有報道認為,在桿菌肽生物合成中亮氨酸起誘導物作用。此外在研究中發現,Lys、Asn對地衣芽抱桿菌有特殊的刺激生長的作用,可視為生長因子,而Phe、Asp、Leu、Lle 、Cys等對生長有明顯的促進作用。因此通過考察發酵液中氨基酸含量的變

10、化情況,可以分析產生菌的代謝途徑,并以此為基礎,研究產物與氨基酸的關系,通過人為的控制,調節代謝流向,最終提高產物產量。同時,作為一個多肽復合體,發酵時同時形成多個活性組分,尋找合適的代謝途徑,選擇性提高組分的產量,也是桿菌肽發酵調控的重要工作內容。85.1碳代謝物的調節作用對桿菌肽的影響在菌體生長階段,被快速利用的葡萄糖等分解產物,阻遏了次級代謝的酶等的合成,只有當這類碳源消耗盡之后,阻遏作用被解除,菌體生長階段轉入次級代謝產物合成階段。例如在桿菌肽發酵中加入葡萄糖,有利于菌體生長,卻抑制了桿菌肽的合成,因為葡萄糖代謝生成有機酸,在酸性條件下引起的葡萄糖降解產生乙酸、丙酸在低pH下呈非解離狀

11、態,容易透過細胞膜,使細胞內pH降低,從而抑制桿菌肽的合成。對桿菌肽來說,與其它多種微生物生產產物不同,我們的試驗表明當加入3%檸檬酸作為碳源時可以不受干擾。因為它能很塊利用,不致產生其它有機酸使pH下降而干擾桿菌肽的合成。所以,桿菌肽發酵生產中選擇適合的碳源種類及用量是很重要的。95.2磷酸鹽的調節作用對桿菌肽的影響通過試驗研究,發現過量的磷酸鹽也含有像葡萄糖一樣抑制次級代謝產物的合成,生產中應引起注意,控制磷酸鹽的用量,以免產物合成受到影響。實驗表明,桿菌肽發酵中無機磷酸鹽的濃度應控制在0.1 1mmol/L,這時可以合成桿菌肽,不受其影響。但是如果濃度高于1mmol/L,則桿菌肽合成明顯

12、受到抑制。磷酸鹽對次級代謝產物合成的影響是由于桿菌肽合成中的前體氨基酸,需經過ATP活化,變成氨基腺嘌呤核苷酸,同時解離出焦磷酸。而過量的磷酸鹽對這步反應產生反饋抑制作用,從而抑制桿菌肽的合成。另一方面,可能改變菌體能荷狀態和阻遏次級代謝產物合成中某些關鍵酶的合成有關。但是磷酸鹽不足時,菌體生長不好,亦會影響桿菌肽的合成。96 本實驗的目的在桿菌肽生產發展過程中,面臨著巨大的挑戰就是高產和質量問題。 桿菌肽的產量并不是單純地擴大生產規模所能解決的問題,如何提高產品的效價，要想提高產量必須首先提高質量發酵液中的效價。 而發酵液中桿菌肽質量高低, 即含量(效價高低),涉及到多方面的因素。 本課題采

13、用獲得的Bacillus licheniformi進行誘變育種，設計育種方案，優化高效篩選條件，開發高產的合成桿菌肽生產菌種。畢 業 設 計（論 文）開 題 報 告參 考 文 獻1程美玲，高士爭.幾種新型安全抗生素類飼料添加劑J.飼料世界，2001（10）：4-6.2李德培.新型抗生素飼料添加劑桿菌肽鋅J.中國飼料,1994,（12）：27-293劉鳳翥.桿菌膚鋅一較好的抗菌素添加劑J.中國飼料,1998,（7）：13-144于飛進,陳衛良.培養條件對 Bacilluscereus 357 生長及產生拮抗物質的影響J.浙江大學學報(農業與生命科學版),2006,163,352- 358.5呂九

14、琢,徐亞賢, 韓錫廣. 桿菌肽鋅生產中雜菌污染的控制J.飼料工業，2001，22（3）：29- 30. 6劉燕,王靜慧.微生態學理論和我國微生態制劑的研究現狀J中國獸藥雜 志,2002,36(8):35- 38. 7沈萍.微生物學M.北京:高等教育出版社,2002.8林綱. 桿菌肽發酵過程中氨基酸等成分的測定方法研究和應用D. 上海醫藥工業研究院碩士學位淪文, 2006. 5. 9 胡尚勤. 桿菌肽高產的代謝調控J . Ca+外醫藥抗生素分冊, 2004, 7, 15(4): 160- 162. 畢 業 設 計（論 文）開 題 報 告2本課題要研究或解決的問題和擬采用的研究手段（途徑）1、 本

15、課題要研究或解決的問題： 獲得高產桿菌肽鋅的微生物2、 擬采用的研究手段：（1） 改變培養基中碳源含量 研究以檸檬酸（鹽）代替葡萄糖作為C源，現有檸檬酸三鈉和檸檬酸胺，以檸檬酸三鈉為例，分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%代替葡萄糖配制培養基，搖瓶培養24h后進行液相檢測。 （2）改變培養基pH pH主要是影響菌體細胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化，以及影響營養物離子化程度，從而影響菌體對養分的吸收。由于搖瓶發酵過程中pH難以控制，因此只能控制發酵液的初始pH值。按種子發酵培養基配方將培養基的初始pH值分別調至6.5、7.0、7.5、8.0按4.0%接種量接種，于37、249r/min

16、搖瓶培養24h，用高效液相色譜法測定桿菌肽含量 （3）前體氨基酸 桿菌肽分子是由谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等 12 個氨基酸組成的含有噻唑環的多肽復合體，因此氨基酸的代謝在桿菌肽的生物合成中起著重要作用，如：Lys、Asn、Phe、Ile、Leu、Asp、Cys 等對生長有明顯的促進作用。而谷氨酸、谷氨酰胺又是細胞氮代謝的重要中轉站，發酵過程中添加的外源谷氨酸，可以促進鳥氨酸等氨基酸的合成過程、增加谷氨酰胺供量以增加細胞代謝所需氮的供給以及為桿菌肽合成提供前體。 (4)紫外誘變 通過使用超凈工作臺的紫外燈來達到紫外誘變的目的，通過不同時間的紫外線照射，將誘變后的菌株于37、249r/min搖瓶培養

17、24h，用高效液相色譜法測定桿菌肽含量。 (8) 金屬離子對桿菌肽產量的影響將篩選后的菌, 接種到培養基中，并分別加入 0 .1 0 .4mol · L -1 磷和不同量硫酸鋅 5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、11 %、12 %、13 %、14 %的液體培養基, 37 振蕩培養 42 h 后,獲得含桿菌肽鋅無菌發酵液.用高效液相色譜法測定桿菌肽含量。三、技術路線：地衣芽孢桿菌懸浮液液體培養稀釋涂平板挑選單菌落斜面單菌落培養搖瓶培養檢測桿菌肽含量篩選出高產菌株紫外誘變液相色譜分析誘變后桿菌肽含量選出高產菌株 3實驗所需試劑、器材：1、 實驗所需試劑：N源： 胰蛋白胨

18、酵母提取物 酵母粉 牛肉膏 多聚蛋白胨 大豆蛋白胨 魚粉（NH4）2SO4 NaNO3 NH4ClC源： 葡萄糖 可溶性淀粉 酒石酸鈉 乙酸鈉 蔗糖 檸檬酸三鈉 無機鹽： MgSO4.7H2O Na2HPO4 KH2PO4 FeSO4.7H2O NaCl試劑： H2O2、75%酒精、 瓊脂糖、P2、試驗所需器材：平板、封口膜試管、試管刷、試管塞、試管架三角瓶、三角瓶刷、紗布燒杯、玻璃棒量筒容量瓶磁力攪拌器電子天平、鑰匙電爐、水鍋200L、1mL、5mL移液槍，1.5mL、5mL離心管，槍頭，EP管搖床烘箱高壓滅菌鍋冰箱、超低溫冰箱高速離心機水浴鍋高效液相色譜儀4、進程安排和采取的主要措施第1階段：（2015年11月）論文選題  第2階段：（2016年1月10