1、蘇州科技學院化生學院學生實驗報告 生物技術大實驗 發酵工程工藝控制生物技術大實驗實 驗 報 告 集班級 生物技術1212 學號 1220212206 姓名 宋揚 使用時間 2015.12.14 至 2015.12.19 組別 一 蘇 州 科 技 學 院 化 學 與 生 物 工 程 學 院實驗室學生守則一、嚴格遵守實驗室各項規章制度和管理措施，服從教師及實驗技術人員的指導。二、嚴格按照實驗要求，做好實驗預習,實驗之前5分鐘進入實驗室，及時、準確地完成實驗任務，實事求是地完成實驗報告，杜絕弄虛作假。三、嚴格執行操作規定，愛護儀器設備及工具。凡不按教師的指導擅自操作引起儀器、設備損壞者，應予賠償。四

2、、愛護實驗室公共財物，節約水電、材料和試劑。未經允許不得隨便挪動非實驗需用的其他儀器，不得隨便拆裝儀器或將儀器、工具帶至室外。五、持實驗室的嚴肅安靜，不得大聲喧嘩、嘻鬧，嚴禁在實驗室內抽煙和吃東西。六、嚴防事故，確保實驗室安全，發現異常情況，應及時向有關教師和管理人員報告。七、每次實驗結束后，主動整理好儀器設備，歸還所借器材，關閉電源、水源，按指導老師的要求做好實驗結束工作及室內外的清潔衛生工作，經指導老師許可后，方可離開。 蘇州科技學院化學與生物工程學院實 驗 報 告實驗名稱輔酶Q10發酵過程工藝控制組別九實驗結果及實驗分析與討論：摘要：通過輔酶Q10產生菌類球紅細菌Rhodobacter

3、sphaeroides的培養，學會菌種在小型發酵罐中培養的過程，包括培養基和設備的滅菌、種子的培養、接種、發酵工藝控制等，進一步鞏固所學的有關發酵過程的控制、中間補料、溶氧控制、變溫發酵及代謝調節等工藝，學會分析代謝曲線，掌握有關參數及輔酶Q10的定量分析方法。關鍵詞：輔酶Q10，補料發酵，葡萄糖量，溶氧測定 輔酶Q10（Coenzyme Q10），是一種位于線粒體上的脂溶性化合物，化學名稱為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌。輔酶Q10的制備方法有組織提取法、微生物發酵法和化學合成法。目前，我國國內多家公司均實現了輔酶Q10的工業化生產，多采用微生物發酵法，且據報道，最高產量已達

4、到3000mg/L。葡萄糖是碳源中最易利用的糖,幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖,所以葡萄糖常作為培養基的一種主要成分,并且作為加速微生物生長的一種有效的糖。適量地增加葡萄濃度可以有效提高產物的合成量。因此，選擇合適的葡萄糖補加方式并合理控制培養基中葡萄糖的濃度有利于產物的合成。 本試驗采用類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides進行深層液體發酵生產輔酶Q10，發酵方式為流加分批發酵。通過流加補料將發酵過程中葡萄糖濃度分別控制在10g/L-15g/L,5g/L-10g/L,探究發酵過程中維持葡萄糖不同濃度對類球紅細菌發酵生產輔酶Q10的影響。一、實驗的儀器和試劑1、儀器BIOTE

5、CH-7BG型發酵罐、高效液相色譜、顯微鏡、臺式離心機、旋轉蒸發儀等。2、菌種類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides3、培養基（1）種子培養基（g/L）：葡萄糖 3，酵母提取物 8，NaCl 2，KH2PO4 1.3，MgSO4·7H2O 0.25, 1mL 輔液（2）發酵培養基(g/L) : 葡萄糖30,甘露醇7.5,玉米漿干粉3，魚粉蛋白胨3，谷氨酸鈉5, NaCl 3.5 硫酸銨 3，KH2PO4 3，MgSO4 ·7H2O 15 ,FeSO4 1.25,MnSO4 0.12,1mL 輔液；用NaOH調pH至 7.0（發酵罐培養基加3ml 泡敵） 輔

6、液（g/L）：鹽酸硫胺 1，生物素0.015，煙酸 1，CuSO4 0.1。（3）補料培養基(g/L)：葡萄糖300（4）發酵消泡劑配比（v）：泡敵水=110。（5）培養基滅菌方法：培養基等配好后在蒸汽滅菌罐內于115下滅菌30分鐘。二、實驗的步驟1、發酵工藝條件路線為平板活化 菌種子斜面 搖瓶種子 罐發酵。2、斜面種子培養從平板培養基上單菌落接種于斜面培養基上，32恒溫培養3d。3、搖瓶種子培養250ml搖瓶加入50 ml 種子培養基，滅菌后冷卻，挖一約0.5cm2小塊斜面放入培養基中，30，200r/min，培養24h。4、發酵（1）罐發酵培養以8%（v/v）接種量接種于5L（裝液3L）發

7、酵培養基中，32，pH6.8±0.2，0.03Mpa，3L/min（初始）,200 r/min（初始），補料分批培養，用氨水自動調節pH，到120小時（45d）左右放罐。接種后培養2-3h后，通過調節空氣流量和轉速，控制溶氧（DO）在50%的水平。發酵液pH會先上升再下降，待其降至6.8，通過補加氨水，控制pH在6.8。每4h測一次葡萄糖含量，計算補料體積，分別維持葡萄糖濃度（A）1211班：葡萄糖濃度維持在10-15 g/L。（B）1212班：葡萄糖濃度維持在5-10 g/L。補料速率：根據還原糖分析結果及溶氧水平情況進行補料（30-60min補料一次）。每班取3個搖瓶測定有關參數

8、。（2）參數測定及記錄在線參數每1hr記錄一次；離線參數每8hr取樣分析一次，包括總糖、還原糖、氨基氮、菌體濃度、pH、輔酶Q10含量等。（3）放罐條件待發酵后期，輔酶Q10產量下降，溶氧上升，pH上升，開始下罐。5、離線參數測定在發酵過程中每4小時取一次樣分析以下項目：(1)美藍染色，鏡檢觀察，并記錄類球紅細菌細胞菌體形態。(2)菌體濃度測定：干重法。（見附錄1）(3)還原糖測定：生物傳感分析儀。（見附錄2）(4)取發酵液離心后的上清液用甲醛滴定法測氨基氮。（見附錄3）(5)輔酶Q10的提取及定量測定：用酸熱法提取Q10（在90水浴鍋加熱，注意不要用電爐加熱），用HPLC測定輔酶Q10的含量

9、。（見附錄4）6、在線參數測定在發酵罐上連續測定pH、溶氧(DO)、轉速、流量、溫度等。7、記錄所測參數，記入輔酶Q10發酵批報表。三、輔酶Q10發酵過程有關離線參數的分析方法1、 菌體濃度的測定(1)菌體濃度的測定用離心法 取5mL菌液于已稱好管重（W0）的10mL離心管中（每次3個平行），4下離心15min，離心轉速為 5000 rpm。離心所得菌體用稀鹽酸溶液(0.05M HCl:約4mL HCl加水至1L)洗滌兩次，稱濕重W1，。注意：洗滌時，要充分震勻。打開離心管蓋，至80烘箱中烘至恒重，稱干菌體與離心管重量W2。(2)計算公式濕重X1=(W1W0)×20干重X2=(W2W

10、0)×20W1：濕菌體與離心管重量，g；W2：干菌體與離心管重量，g；W0：離心管重量，g；單位：g/L。2、發酵液中還原糖測定生物傳感分析儀測定發酵液中還原糖測定操作在“準備就緒”狀態下，按“運行”鍵，儀器自動清洗2次，以更新反應池和管道內的緩沖液，清洗結束后進入自動定標狀態。這時，注入25ml標樣，儀器自動開始測定標樣并定標，測定完成后，自動清洗一次，進入下一測定循環。儀器根據上次定標時的測定誤差，自動判斷是否需要繼續定標，如需要，則再次提示定標。當完成儀器標定后，綠燈不再閃爍，儀器進入測定樣品狀態。注入25ml樣品，根據結果確定要稀釋的倍數。初始為40倍。3、發酵液中氨基氮的測

11、定（一）實驗材料(1)中性甲醛溶液將試劑級甲醛（36-37%）調到PH7（用 PH計檢查）。或是在50ml36-37%甲醛中加入幾滴0.5酚酞乙醇水溶液，然后用0.2N氫氧化鈉溶液滴定到微紅。（需臨用前配制，若放置一些時間后，在使用前要重新中和。）(2)酚酞指示劑0.5%酚酞的50%乙醇溶液。(3)標準堿溶液0.1N 氫氧化鈉溶液，使用前應標定。(4)溴酚蘭指示劑0.05%溴酚蘭的20%乙醇溶液。（二）實驗方法(1)分別吸取發酵液離心上清液2.0ml于兩個磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入7ml蒸餾水，做空白對照。(2)向上述三個瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，混勻

12、，加溴酚蘭指示劑2滴，加酚酞指示劑4滴。(3)用標準0.100mol/LNaOH溶液滴定至紅色，分別紀錄消耗的NaOH毫升數。4、菌體中輔酶Q10含量提取與測定(1)菌體細胞的破碎酸熱法：酸熱法處理菌體主要是利用鹽酸對細胞中的糖及蛋白質等成分的作用,疏松細胞的結構，再經過沸水、冷凍處理，使細胞達到破碎的效果，輔酶Q10得率相對較高，操作也相對簡單。酸熱法：取1ml發酵液，加入0.2mL 0.1 mol/L的鹽酸，于90°C水浴鍋中，水浴處理15 min。破壁好迅速冷卻，5000rpm離心10min，棄盡上清。加入5mL提取液（乙酸乙酯：乙醇=5:3，體積比），漩渦震蕩儀上混勻，置于超

13、聲波清洗儀中超聲抽提15min,暗室中抽提15min,每隔5min搖勻一次。將抽提液離心10min。上層有機相0.46m濾頭過濾，待測。(2)輔酶Q10含量的分析輔酶Q10用HPLC進行分析，液相分析儀器為安捷倫，色譜柱為C18反相柱（5m×4.6mm×150mm）。流動相為甲醇：異丙醇=3：1，柱溫箱為40，流速為1mL/min，檢測波長是275nm。輔酶Q10標準品梯度稀釋后經HPLC分析建立。輔酶Q10標準曲線：y=0.06729x R2=0.99996 (x為峰面積，y為輔酶Q10濃度mg/L)菌體中輔酶Q10含量y=0.06729*5x=0.33645x (提取時

14、，輔酶Q10稀釋了5倍)四、實驗結果菌體量隨著時間增加而增長，而輔酶Q10 含量也隨著菌體量的增長而變大。后期因為菌體量的減少，Q10產量也開始降低。下罐。 還原糖濃度（柱狀圖）還原糖濃度不斷下降，在24小時開始每隔一段時間補充葡萄糖，使葡萄糖含量維持在6左右。一開始溶氧在100%，隨著菌體生長發酵，開始下降，控制在30%左右，隨著菌體增加，降為0，后期發酵罐變粘，影響氧氣傳遞。前期消耗氮源，產氨，pH上升，隨著菌體生長繁殖，消耗碳源，產酸，pH下降，糖缺乏時，pH上升，補充碳源，使pH維持在6.8左右。當pH過低時，通過補加氨水，使pH維持穩定。實驗成績： 教師： 日期： 實 驗 報 告五、

15、參考文獻【1】李嘯·生物工程專業綜合大實驗指導·北京：化學工業出版社，2009【2】陳長華·發酵工程實驗·北京：高等教育出版社，2009【3】黃儒強，李玲·生物發酵技術與設備操作·北京：化學工業出版社，2006學 期 實 驗 小 結 轉眼間，我已從懵懂的大一新生變成了大四老生，我開始漸漸覺得焦慮，以及對未來的恐懼。不知道自己的未來會怎么樣，雖然確定了一定要考研，可是也不知能不能考上理想的學院。否則，就要踏上未知的社會，開始另一段人生必要的過程。 在本學期剛過一半時段的時候我們開始了“傳說”中的大實驗，畢竟我們大一到大三的實驗都是比較容易的，花時間較少的，沒有這么長時間的，而且要花很多精力。更重要的是還有來自考研的壓力。雖然一度想過要放棄做這個實驗，不過我還是認真的做了，雖然做的并不理想。其實，對這個實驗我還是很上心，雖然不怎么想做，想要集中精力好好考研。 這次的實驗是連續發酵測定輔酶Q10，這個實驗出了要