1、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化 作者：袁春燕 牛膺筠 張瑞 丁玉枝 【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜;再灌注損傷;基因,WTp53;基因,bax;基因,bcl-2;大鼠,Wistar 摘要目的 研究視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RIRI）中凋亡相關(guān)基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2表達(dá)的變化，探討其作用機(jī)制。方法將28只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、缺血組，其中缺血組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個(gè)組。建立RIRI動(dòng)物模型，用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測再灌注后不同時(shí)段視網(wǎng)膜組織中WTp53、bax和bcl-2基因表達(dá)的變化

2、。結(jié)果 缺血組視網(wǎng)膜再灌注后WTp53、Bax蛋白表達(dá)增加，與正常組比較，再灌注672 h差異有顯著意義（ F=487.19、281.97，q=11.526 52.401 ，P <0.05）。缺血組視網(wǎng)膜再灌注后Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化，與正常組比較，差異無顯著性（ P >0.05）。結(jié)論 缺血再灌注損傷引起WTp53、bax基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層與內(nèi)核層表達(dá)增高;WTp53和bax可能通過誘導(dǎo)或促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡參與了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生。 關(guān)鍵詞 視網(wǎng)膜;再灌注損傷;基因，WTp53;基因，bax;基因，bcl-2;大鼠，Wistar 1

3、 / 11ABSTRACTObjectiveTo investigate the expression of WTp53，bax and bcl-2 in retina ischemia/reperfusion injury and explore the mechanism. MethodsTwenty-eight rats were randomly divided into normal （4 rats） and ischemia group， and the latter was subdivided into 1，6，12，24，48，and 72h after reperfusio

4、n， respectively. The rat model of experimental retina ischemia/reperfusion injury was made by increasing the intraocular pressure. The expression of WTp53， bax and bcl-2 was determined by streptavidin-biotin complex （SABC） immunohistochemistry. Results In ischemia group， WTp53 expression and bax exp

5、ression increased significantly （ F=487.19，281.97;q=11.526-52.401; P <0.05），while the bcl-2 expression had little change. Conclu-sionWTp53 and bax expression increase in RIRI. WTp53 and bax may play a part in RIRI by promoting apoptosis. KEY WORDSretina; reperfusion injury; genes，WTp53; genes

6、， bax; genes， bcl-2; rats， Wistar 視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科常見的病理過程，嚴(yán)重影響病人視功能。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，已成為近年眼科的研究熱點(diǎn)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中存在著神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且凋亡是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞丟失的重要因素之一1。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，研究凋亡相關(guān)基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2的表達(dá)變化，探討視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1動(dòng)物及分組 健康無眼疾的Wistar大鼠（青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）28只，體質(zhì)量2503

7、00 g，雌雄不拘，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。隨機(jī)分為兩組:正常組（4只）、缺血再灌注組（24只），其中缺 血再灌注組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個(gè)組，每組4只大鼠。 1.1.2主要試劑 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司生產(chǎn)），鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組化試劑盒（武漢Boster生物工程公司）。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1動(dòng)物模型的建立 采用前房穿刺加壓法建立大鼠缺血再灌注損傷模型，方法見文獻(xiàn)2。 1.2.2標(biāo)本的取材、固定與切片 分別于再灌注后1、6、12、24、48、72 h處死動(dòng)物，摘除眼球，制作石

8、蠟切片，方法見文獻(xiàn)2。 1.2.3免疫組織化學(xué)染色 將標(biāo)本的石蠟切片脫蠟至水，用蒸餾水新鮮配制體積分?jǐn)?shù)0.03過氧化氫室溫放置10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，復(fù)合消化液室溫浸浴10 min修復(fù)抗原，正常山羊血清室溫 10 min封 閉非特異性抗原，加一抗（兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗） 37 孵育2 h， 加二抗（生物素化山羊抗兔IgG）37 水浴20 min，SABC法染色，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。 1.2.4結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)處理 每只眼球取兩張切片進(jìn)行分析，應(yīng)用雙目光學(xué)顯微鏡（400倍）分別觀察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)（陽性染色呈棕黃色

9、）。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對免疫組化切片進(jìn)行圖像分析（每張切片取4個(gè)視野，以視神經(jīng)為基準(zhǔn)分別向兩側(cè)各取2個(gè)視野），對視網(wǎng)膜組織中WTp53和Bax蛋白表達(dá)進(jìn)行相對定量。 2 結(jié)果 2.1WTp53蛋白的表達(dá)變化 正常大鼠視網(wǎng)膜中幾乎無WTp53蛋白表達(dá)。WTp53蛋白于再灌注6 h開始在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層少量表達(dá)，位于細(xì)胞核內(nèi)，以后表達(dá)量逐漸增加，24 h達(dá)到高峰，此時(shí)除在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有強(qiáng)表達(dá)外，內(nèi)核層也有散在的表達(dá);48 h仍持續(xù)強(qiáng)表達(dá); 72 h明 顯下降，但仍較正常組為高。再灌注6、12、24、48、72 h的WTp53蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。 2.2 Bax蛋白的

10、表達(dá)變化 正常大鼠視網(wǎng)膜中幾乎無Bax蛋白表達(dá)。Bax蛋白于再灌注6 h開始在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有表達(dá)，位于細(xì)胞漿中，以后表達(dá)量逐漸增加，24 h達(dá)到高峰，此時(shí)除在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有強(qiáng)表達(dá)外，內(nèi)核層也有散在表達(dá);48 h已有所下降，但仍表達(dá)較強(qiáng);72 h明顯下降。再灌注6、12、24、48、72 h的Bax蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。 2.3Bcl-2蛋白的表達(dá)變化 正常組視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白低表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層及內(nèi)核層。缺血再灌注后各時(shí)間段表達(dá)差異無顯著性。再灌注6、12、24、48、78 h的Bcl-2蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異無顯著性（ P &am

11、p;gt;0.05）。見表1。 表1 視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段WTp53、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化（略） 與正常組比較， F=487.19，281.97，* q=11.52652.401， P < 0.05 3 討論 有研究顯示，大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后發(fā)生視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且凋亡在再灌注后6 h升 高， 24 h 達(dá)到高峰，之后有所下降1，2。凋亡是基因 介導(dǎo)的具有新的蛋白質(zhì)合成的程序性死亡，細(xì)胞凋亡是級聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。基因調(diào)控也在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用3。細(xì)胞 內(nèi)部的基因直接控制著凋亡的發(fā)生與發(fā)展，細(xì)胞外部因素通過信號(hào)傳導(dǎo)而影響這些基因的

12、表達(dá)，間接地調(diào)控細(xì)胞凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)多種基因編碼的產(chǎn)物參加了凋亡的控制，WTp53、bax和bcl-2為其中的重要成員，其中WTp53、bax為促凋亡基因，而bcl-2屬于抑凋亡基因。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)伴隨著WTp53基因高水平的表達(dá)4，5。應(yīng)用WTp53基因的抑制物可防止細(xì)胞凋亡6，提示W(wǎng)Tp53基因在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。國漢邦等7構(gòu)建了含有WTp53基因的重組腺病毒載體，用此病毒感染胚胎大鼠神經(jīng)細(xì)胞，觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，結(jié)果顯示，WTp53基因?qū)肟烧T導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測顯示，視網(wǎng)膜缺血再灌注后WTp53蛋白表達(dá)增加，主要位于神經(jīng)

13、節(jié)細(xì)胞層與神經(jīng)纖維層。其表達(dá)規(guī)律為:再灌注后6 h開始表達(dá)，24 h達(dá)高峰，72 h明顯減少，與牛膺筠等2研究結(jié)果相符。提示W(wǎng)Tp53的過表達(dá)可能參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。bax基因位于染色體19q13.3-13.4，含有6個(gè)外顯子，許多學(xué)者提出bax與bcl-2關(guān)系密切，而且bax是受p53調(diào)控的下游基因，在眾多凋亡相關(guān)基因中，bcl-2、bax和p53之間的關(guān)系及其對凋亡的調(diào)控機(jī)制倍受關(guān)注。CHEN等8報(bào)道，bcl-2 mRNA陽性神經(jīng)細(xì)胞再灌注后可延長存活時(shí)間，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞存活;Bcl-2/Bax蛋白的比例決定細(xì)胞凋亡的趨勢，Bcl-2/Bax的比例升高可抑制細(xì)胞

14、的凋亡，反之，則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而bax與p53 mRNA陽性細(xì)胞隨再灌注時(shí)間延長多趨于死亡，P53蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞多死亡。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜Bax蛋白在缺血再灌注后6 h即有表達(dá)， 24 h達(dá) 到高峰，48 h開始下降，但仍維持較高的水平，至72 h明顯減少。 與文獻(xiàn)2研究結(jié)果相似。而bcl-2屬抑凋亡基因，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)缺血再灌注處理后各時(shí)間段Bcl-2蛋白表達(dá)無變化，也證實(shí)了在視網(wǎng)膜缺 血再灌注損傷中凋亡調(diào)控系統(tǒng)向促進(jìn)凋亡方向發(fā)展。綜上所述，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后促凋亡基因WTp53和bax表達(dá)增加，而抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)無明顯變化。推測WTp53和bax可能通過誘導(dǎo)或促進(jìn)神經(jīng)

15、節(jié)細(xì)胞凋亡參與了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生。 參考文獻(xiàn) 1 KANEDA K， KASHII S， KUROSAWA T， et al. Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transi-ent ischemia of the rat retinaJ. Brain Res， 1999，815:11-20. 2 牛 膺筠，張瑞，周占宇，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長因子對鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療作用J.中華眼科雜志，2002，38（9）:530-534. 3 袁 春燕，趙穎. 堿性成纖維細(xì)胞生長因子與視網(wǎng)膜缺

16、血再灌注損傷J.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，39（2）:216-217. 4 WOOD K， YOULE R. The role of free radicals and P53 in neuron apoptosis in vivo J. Neurosci， 1995，15:5851-5857. 5 LA FERIA F， HALL C， NGOL， et al. Extracellular deposi-tion of -amyloid upon P53-dependent neuronal cell death in transgenic mice J. Clin Invest， 1996，98:1626-1632. 6 蔣 雷，夏永靜，黎健. 野生型P53基因?qū)雽ε囵B(yǎng)的兔血管平滑肌細(xì)胞生長的抑制作用J.中華心血管病雜志，1997，25:301-