1、食品微生物學實驗是為生物工程、生物技術等專業選修課程食品微生物學開設的實驗，包括兩部分內容：一是微生物發酵食品加工，如甜酒釀的釀制，酸乳的制作、豆腐乳的制作、面包的制作等；二是食品中微生物的檢驗，包括常規檢驗如菌落總數、大腸菌群的檢驗和致病性微生物的檢驗等。第一篇 微生物食品加工實驗一 甜酒釀的制作一、目的1、通過甜酒釀的制作了解釀酒的基本原理。2、掌握甜酒釀的制作技術。二、原理以糯米（或大米）經甜酒藥發酵制成的甜酒釀，是我國的傳統發酵食品。我國釀酒工業中的小曲酒和黃酒生產中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發展而來的。甜酒釀是將糯米經過蒸煮糊化，利用酒藥中的根霉和米曲霉等微生物將原料中糊化后的

2、的淀粉糖化，將蛋白質水解成氨基酸，然后酒藥中的酵母菌利用糖化產物生長繁殖，并通過酵解途徑將糖轉化成酒精，從而賦予甜酒釀特有的香氣、風味和豐富的營養。隨著發酵時間延長，甜酒釀中的糖分逐漸轉化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故適時結束發酵是保持甜酒釀口味的關鍵。三、材料1、材料：糯米、酒藥2、儀器和器具：手提高壓滅菌鍋，不銹鋼絲碗，濾布，燒杯，不銹鋼鍋。四、流程原料選擇洗米蒸飯淋水降溫落缸搭窩接種保溫發酵后熟質量評估五、方法1、洗米蒸飯將糯米淘洗干凈，用水浸泡4h，撈起放于置有濾布的鋼絲碗中，于高壓鍋內蒸熟（約0.1Mpa，9min），使飯“熟而不糊”。2、淋水降溫用清潔冷水淋洗蒸熟的糯米飯，使其

3、降溫至35左右，同時使飯粒松散。3、落缸搭窩將酒藥均勻拌入飯內，并在洗干凈的燒杯內灑少許酒藥，然后將飯松散放入燒杯內，搭成凹形圓窩，面上灑少許酒藥粉。蓋上培養皿蓋。4、保溫發酵于30進行發酵，待發酵2天后，當窩內甜液達飯堆2/3高度時，進行攪拌，再發酵1天左右即可。六、結果1、發酵期間每天觀察、記錄發酵現象。2、對產品進行感官評定，寫出品嘗體會。七、思考1、制作甜酒釀的關鍵操作是什么？2、發酵期間為什么要進行攪拌？實驗二 酸乳的制作一、目的1、掌握酸乳制作原理2、學會酸乳的制作方法二、概述酸奶因具有清新爽口的味覺而倍受歡迎 , 又由于酸乳中會有乳酸菌的菌體及代謝產物,它對腸道內的致病菌有一定的

4、丑掣作用,故對人體的腸道消化道疾病有良好的治療效果。三、原理酸乳是以牛乳為主要原料，接入一定量的乳酸菌，經發酵后而制成的一種乳制品飲料,當乳酸菌在牛乳中生長繁殖和產酸至一定程度時,pH下降，使乳酪蛋白在其等電點附近發生凝集，這種凝乳狀酸奶稱為凝固型酸奶。四、器材鮮牛奶、奶粉、蔗糖、菌種(或市售酸乳)、天平、燒杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒溫水浴鍋、恒溫培養箱、冰箱、不銹鋼鍋。五、方法（一）凝固型酸奶制作在添加生產發酵劑后立即進行包裝,并在包裝容器中發酵而成,成品呈凝乳狀。1、工藝流程蔗糖、脫脂奶粉 原料鮮奶一凈化一脂肪含量標準化一配料一過濾一預熱一均質一殺菌-冷卻-接種一分裝一發酵一冷卻一后熟。2、操

5、作步驟（1）牛奶瓶消毒：將牛奶瓶在不銹鋼鍋里用沸水煮15分鐘。（2）牛乳的凈化：利用特別設計的離心機,除去牛乳中的白血球和其他肉眼口見的異物。（3）脂肪含量標準化：鮮奶中脂肪含量比較高,為了避免酸奶中有脂肪析出,因此需要對鮮奶的脂肪含量進行調整使其達到所要求的標準。可以在脂肪含量高的牛乳中,加入一定體積的脫脂乳,或通過分離機,從牛乳中分離出稀奶油,然后在得到的脫脂乳中再摻入一定量稀奶油,使調制乳的脂肪含量達到要求。（4）配料a.奶粉的添加:經脂肪含量標準化處理的調制乳(或按1：7的比例加水把奶粉配制成復原牛奶)，為了使其非脂干物質含量達到要求,一般往調制乳中添加脫脂奶粉,經如此處理的酸奶有一定

6、的硬度,脫脂奶粉的添加量一般為1%-3%。b.蔗糖的添加：為了緩和酸奶的酸味,改善酸奶的口味,一般在調制乳中加入4%-8%的蔗糖,如果蔗糖量加入過多,會因調制乳滲透壓的增加而阻礙乳酸菌主長一般是先將原料乳加熱到60左右,然后加入蔗糖,待糖溶解后,過濾除雜,經過濾的奶液再進行均質處理。（5）均質：用于制作酸奶的原料乳一般都要進行均質處理,經過均質處理,乳脂肪被充分分散酸奶不會發生脂肪上浮現象,酸奶的硬度和粘度都有所提高,而且酸奶口感細膩,更易被消化吸收,將加熱和均質兩種方法適當結合起來,處理的效果會更好,一般是先將原料乳地墊至60左右,然后在均質機中,于8-1OMpa壓力對乳進行均質處理。（6）

7、滅菌：均質后的原料乳的滅菌方法大致有兩種:將乳加熱至90,保溫5min,或置于80恒溫水浴鍋中滅菌15分鐘,也可用超高溫瞬時滅菌法（在135下保溫2-3s）。滅菌目的有以下幾點：殺滅原料乳中的微生物,特別是致病菌。形成乳酸菌生長促進物質,破壞乳中存在的阻礙乳酸菌生長的物質。除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的變性而增加的-SH,從而使氧化還原電位下降,助長乳酸菌的生長。使乳清蛋白變性膨潤,從而改善酸奶的硬度和粘度,并阻止水分從變性酷蛋白凝聚成的網狀結構中分離出來。滅菌后,使乳中原本存在的酶失活,使發酵過程成為單一乳酸菌的作用過程,易于控制生產。經滅菌處理后的原科乳迅速冷卻到43-45待接種。（7）

8、接種：向43-45滅過菌的原料乳中加入工作交酵劑,接種量為2-3%，通常是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌，兩種菌的比例為1:1或2：1。球菌的接種量稍多些,可彌補由于桿菌生長產酸而阻礙球菌生長所造成的球菌數量不足的缺點。經實驗證明，當接種量超過3%時,發酵所需時間并不因種量加大而縮短,而酸奶的風味由于發酵前期酸度上升太快反而變差,所以,任意加大接種量是無益的,反之,若接種量過小,發酵所需時間延長,酸奶的酸味會顯得不夠。（8）分裝：酸奶受到振動,凝乳狀態易被破壞,因此,不能在發酵罐中先發酵然后再進行。分裝,必須是將會有乳酸菌的牛乳培養基先分裝到銷售用的玻璃瓶或塑料小容器中,加蓋后送入恒溫室培

9、養,在容器中發酵制成酸奶,為了避免雜菌的侵入,分裝操作應在無菌室中進行。牛乳分裝后,容器上部留出的空隙要盡可能小,這樣容器中的內容晃動幅度小,酸奶的形態易保持完整,另外,減少空氣也有利于乳酸菌的生長。整個分裝操作的時間要短,使乳液溫度下降少,這樣乳液溫度與所設定的發酵溫度接近,整個發酵時間就不會被延長。（9）發酵:將裝有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒溫箱中進行發酵,恒溫箱的溫度保持在40-43,時間為3-4小時,或30培養18-20小時,發酵終點的確定有兩種方法:a.發酵奶的酸度已達到65-70oT,用0.1moL/L NaOH 標準溶液滴定10ml樣品,每消耗掉 1mLNaOH溶液稱為1滴定酸度

10、(oT)或PH=4-5；b.發酵奶的流動性變差,基本凝固。(10)冷卻:發酵結束,在將酸奶移放進冷藏室進行貯存和后熟處理之前,應將酸奶從發酵室中取出,用冷風迅速將其冷卻到10以下使酸奶中的乳酸菌停止生長,防止酸奶酸度過高而影響口感。(11)后熟:酸奶在形成凝塊后應在4-7下保持24小時以上,以獲得酸奶特有風味和較好口感。(12)冷藏:經冷卻處理的酸奶貯藏在2-5,最好是-1-0的冷藏室保存,低溫保存有以下優點:保存期間,酸奶的酸度上升極少；牛乳凝固時會產生收縮力,導致乳清折出,在低溫時這種收縮力比較弱,所以乳清不易從酸奶中分離出來；低溫下酸奶逐漸形成白玉般的組織狀態,結構非常細膩；低溫保存過程

11、中,香味物質逐漸形成,使酸奶具有較濃香味。(13)品味：酸奶應有凝塊,質地細膩,酸甜適中,清新爽口,若有不良異味,則很可能是酸奶污染了雜菌。（二）攪拌型酸奶的制作 在發酵罐中接種生產發酵劑,凝固后,再經攪拌入杯成其它容器中,產品凝乳粒子直徑保持在0.01-0.04mm大小。呈半流動狀態的粥糊狀,易使用吸管吸食。1、工藝流程原料鮮奶配料預熱均質殺菌冷卻接種攪拌發酵冷卻攪拌混合裝瓶冷卻后發酵 輔料2、操作步驟(略)(三)飲料型酸奶將凝固型酸奶均質處理后,使凝乳充分分散,凝乳粒子直徑在0.01mm以下的酸奶,這種酸奶的特點是與牛乳相似,呈液體狀。1、工藝流程凝固型酸奶混合均質分裝冷卻冷藏 穩定劑溶液

12、2、操作步驟(1)凝固型酸奶的制備(略)(2)混合:為了防止飲料型酸奶產生分層現象,一般在疑固型酸奶中加入穩定劑,然后再用均質機破乳,由于增加了穩定劑,即使在冷藏期間也不會發生酸奶分層現象。根據來源,可將穩定劑分成兩類:人工合成穩定劑,如海藻酸丙二醇酶(PGA)等；天然穩定劑,如明膠、瓊脂、海藻酸納和果膠等。穩定劑的種類、添加量和添加方式,對于制備凝固塑酸到十分重要。目前在酸奶中使用得較多的是低甲氧基果膠(LM果膠)。一般加入量為0.3%,使用時，先將LM果膠用水溶解,經滅菌后冷卻到接近酸奶的溫度(20-15),然后加入酸奶中攪勻。(3)均質:在1OMPa壓力下,將上述酸奶進行均質處理。(4)

13、分裝:均質后的酸乳液,灌裝到銷售用的小容器中后,迅速冷卻到10以下。(5)冷藏:飲料型酸奶會有活乳酸菌,因此應置于O-5冷藏。(四)果汁酸奶果汁酸奶是在凝固型酸奶中添加果汁和穩定劑后，再經均質處理制成的。1、工藝流程低酸味凝固型酸奶混合均質分裝冷卻冷藏 果汁、穩定劑2、操作步驟(1)低酸味凝固型酸奶的制備:果汁(露)的添加會增加酸奶的酸味,因此在接種時,將嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌兩者的比例改變成10:1,目的是減少保加利亞乳桿菌產生的乳酸,這樣可避免產生酸味過強,制備低酸味凝固型酸奶的其它操作步驟,與一般凝固型酸奶的制法相同。(2)混合:將酸奶和滅菌后冷卻到15-20的果汁(露)按4:1混合

14、,同時加入適量滅過菌的穩定劑水溶液,攪拌均勻。(3)均質:在1OMpa壓力下,將上述酸奶進行均質處理。(4)分裝:將經均質處理過的果汁酸奶乳液灌裝到銷售用的小容器中,迅速將其冷卻到10以下。(5)冷藏:冷卻后的酸奶,置于O-5的冷藏室中冷藏。(五)殺菌型酸奶由牛乳制成酸奶后,用加熱方法將酸奶中所有微生物殺滅的一種酸奶,此種酸奶特點是:不存在乳酸菌和其它微生物,保存期中酸奶酸度不會改變,且保存期延長,但凝乳經加熱后,十分容易折出乳清,需在發酵前加穩定劑,滅菌后酸奶的營養價值也有所降低。1、工藝流程糖、奶粉、穩定劑 -攪拌型酸奶- 發酵-殺菌- -無菌分類脂肪含量標準化牛乳配料過濾均質分裝 -飲料

15、型酸奶- -發酵-殺菌-凝固型酸奶2、操作步驟殺菌型酸奶除多了一步殺菌工序外,其它操作步驟與凝固型酸奶基本相同。殺菌:微生物在酸性環境中對溫度十分敏感,當PH為4.O-4.5時,65加熱5min就能夠把酸奶中的微生物殺死制作殺菌型酸奶常使用這種方法。其它步驟(略)。(六)冷凍酸奶在酸奶中添加糖和香料,按照冰淇淋生產工藝加工成保健飲料。按冷凍酸奶是否含有活菌,可將其劃分為活菌型冷凍酸奶和殺菌型冷凍酸奶兩種類型活菌型冷凍酸奶在-25貯藏一年活乳酸菌殘存50%-80%，殺菌型冷凍酸奶是將酸奶中活乳酸菌殺死因此成品性能穩定。1、工藝流程糖液殺菌冷卻 酸奶混合均質攪拌、分裝攪拌型冷凍酸奶冷藏 香料 快速

16、冷凍(-35)凝固型冷凍酸奶冷藏2、操作步驟(1)牛乳的凈化、脂肪含量標準化和配料的操作方法與制作凝固型酸奶相同。(2)將原料加熱至75,然后用均質機進行二段均質(均質壓力為13.538Mpa,3.434Mpa)(3)均質后的乳加熱到85,保溫10min,接著將此滅菌奶冷卻到44。(4)接種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌液(1：1),接種量為2%-3%。(5)在43左右發酵6-7h,終止時酸奶的pH值為4.7-5.0。(6)在上述酸奶中添加經殺菌冷卻的糖液和香料,充分混合后,在143Mpa 壓力60 下均質,接著,將均質奶冷卻到45,成熟數小時后分裝。最后送入-35冷庫,快速冷凍硬化,得到

17、凝固型冷凍酸奶,也可以將成熟后的酸奶不經過冷凍硬化,在分裝后直接冷藏保存制成攪拌型冷凍酸奶。六、注意事項(1)選擇優質、新鮮的牛奶和酸奶(作為菌種)。(2)嚴格無菌操作,盡量避免雜菌污染。(3)酸乳制好后,應在O-5下保藏,保質期為5天。附一:原料奶質量要求a.來源于健康牛所產的乳,色澤呈乳白色或微黃色,氣味芳香、無異味初乳、末乳、細菌污染乳均不得使用。b.乳牛注射抗生素后所產出乳,四天內不得使用。生產前應做小樣。c.總乳固體不低于11.5%,非脂乳固體大于8.5%。d.原料中不得含堿及菌劑等雜質。e.奶溫不高于10,70度酒精試驗無絮狀物沉淀。附二:酸牛奶衛生標準1、感官指標呈乳白色或和稍帶

18、淡黃色,具有清香純凈的乳酸味,凝塊稠密結實均勻，無氣泡,允許少量乳清折出。2、理化指標項目指標脂肪含量/%3.0酸度（以乳酸計）/%0.63-0.99汞含量（以Hg計）mg/kg-10.013.細菌指標項目指標大腸菌群/個（100mL）-190致病菌（系指腸道致病菌及致病性球菌）不得檢出實驗三 面包的制作一、目的1、掌握面包制作的原理、工藝。2、學會面包的制作方法。二、概述面包是產小麥國家的主食，幾乎世界各國都有生產。它是以面粉為主要原料，以酵母菌、糖、油脂和雞蛋為輔料生產的發酵食品，其營養豐富，組織蓬松，易于消化吸收，食用方便，深受消費者喜愛。三、原理酵母加入面粉和水的混和合物中后,在28左

19、右的溫度下,利用面粉中含有少量單糖與蔗糖開始生長繁殖,在生長繁殖的同時,面粉中的-淀粉酶能將面粉中的淀粉轉化為麥芽糖。 -淀粉酶2(C6H1005)+2nH20n(C12H22011)淀粉 麥芽糖麥芽糖的增加,為酵母菌進一步生長發酵提供了可利用的營養物質。酵母菌菌體本身能夠分泌麥芽糖酶和蔗糖酶,將麥芽糖和蔗糖分解成單糖,供酵母菌利用。 麥芽糖酶(C12H22011)+H202C6H1206麥芽糖 葡萄糖 蔗糖轉化酶(C12H22011)+H20C6H1206+ C6H1206蔗糖 葡萄糖 果糖酵母菌利用這些糖類及其它營養物質先后進行有氧呼吸和無氧呼吸,產生二氧化碳、醇、醛和一些有機酸等產物。有

20、氧呼吸C6H1206+6O26CO2+6H20+674千卡無氧呼吸C6H1206C2H5OH+2CO2+24千卡生成的二氧化碳由于被面團中的面筋包圍,不易跑出,留在面團內,從而使面團逐漸胖大。發酵后的面團,經揉搓成型醒發后,放入200左右的烤爐中烘烤。由于面團內的二氧化碳受熱膨脹,逸散,從而使面包充滿多孔,形成海綿狀。在發酵中形成的其它物質如乙醇、乳酸、醋酸、醛酮類等有機化合物,在烘烤中形成了面包特有的香味。四、原料與器材面粉、白糖、油脂、酵母、改良劑、不銹鋼鍋、托盤天平、量筒、調羹、恒溫箱、不銹鋼刀、瓷盤、遠紅外電熱烤箱。五、操作步驟1、原輔料配方:面粉100%；水45-55%；干酵母0.8

21、-1.5%；改良劑1%；白糖20%；油脂8%-10%。2、面團第一次發酵:將面粉的50%全部酵母、改良劑、白糖及適量的水調制成面團,讓面團在28-30下發酵2-4小時。3、面團第二次發酵:將剩余的原輔料拌入經過第一次發酵的面團中攪拌均勻后在28-30下發酵1.5-2小時。4、成型:將發酵好的面團,按要求切成小塊加工成各種形狀,注意應搓得均勻飛緊密，不要使表面有裂紋。5、醒發:將面包壞放入烤盤,表面刷上一層清水,在40下醒發約30min(烤盤底部涂一些油)。6、烘烤:將面包坯放入烤箱中,在約200溫度下烘烤8-10分鐘。7冷卻:面包出爐后,溫度很高,須經冷卻后才能包裝和貯藏。六、面包質量要求色:

22、面包的表面應為金黃色或棕黃色,色澤均勻一致,富有光澤,無烤焦或發自現象,內部顏色潔白。形:面包表面應光滑,無撒粉粒、氣泡、裂紋、粘邊現象,外形應符合各種形狀面包要求,內部組織氣孔細密均勻,富有彈性。香:香味純正,有面包特有香味。七、注意事項1、注意料的適度,尤其是面粉與水的配比。2、嚴格控制面團發酵,醒發和面包烘烤的溫度與時間,尤其是烘烤時,要防止烤焦。3、在面包制作過程中,自始至終都要注意衛生。實驗四 酸乳中乳酸菌的測定一、目的1、解酸乳中乳酸菌分離原理2、學習并掌握酸乳中乳酸菌菌數的檢測方法。二、原理活性酸奶需要控制各種乳酸菌的比例，有些國家將乳酸菌的活菌數含量作為區分產品品種和質量的依據

23、。由于乳酸菌對營養有復雜的要求，生長需要碳水化合物、氨基酸、肽類、脂肪酸、酯類、核酸衍生物、維生素和礦物質等，一般的肉湯培養基難以滿足其要求。測定乳酸菌時必須盡量將試樣中所有活的乳酸菌檢測出來。要提高檢出率，關鍵是選用特定良好的培養基。采用稀釋平板菌落計數法，檢測酸奶中的各種乳酸菌可獲得滿意的結果。三、材料1、培養基MRS培養基，改良CHALMERS培養基，M17培養基。2、儀器和器具無菌移液管（25ml,1ml），無菌水（225ml帶玻璃珠三角瓶，9ml試管），無菌培養皿，旋渦均勻器。恒溫培養箱。四、流程酸奶稀釋制平板培養檢查計數五、方法1、樣品稀釋先將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品

24、25ml加入盛有225ml無菌水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖，務必使樣品均勻分散，即為10-1的樣品稀釋液，然后根據對樣品含菌量的估計，將樣品稀釋至適當的稀釋度。2、制平板選用23個適合的稀釋度，培養皿貼上相應的標簽，分別吸取不同稀釋度的稀釋液1ml置于平皿內，每個稀釋度作2個重復。然后用溶化冷卻至46左右的MRS或改良CHALMERS培養基倒平皿，迅速轉動平皿使之混合均勻，冷卻成平板。3、培養和計數將平皿倒置于40恒溫箱內培養2448h，觀察長出的細小菌落，計菌落數目，按常規方法選擇30300個菌落平皿進行計算。六、結果1、指示劑顯色反應乳酸菌的菌落很小，13mm，園形隆起，表面光滑或

25、稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色。由于產酸菌落周圍能使CaCO3產生溶解圈，酸堿指示劑呈酸性顯色反應。2、鏡檢形態必要時，可挑取不同形態菌落制片鏡檢確定是乳桿菌或乳鏈球菌。保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、或雙桿菌或長絲狀。嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對、或短鏈、或長鏈狀。3、參照比較據介紹，改良CHALMERS培養基的檢出率較MRS培養基高，M17培養基較適合于乳球菌的培養，在檢測時可同時使用多個培養基作比較。七、思考1、為什么乳酸菌的檢測關鍵是選用特定良好的培養基？2、培養基中為什么要加CaCO3？第二篇 食品中各類微生物檢驗 本篇主要包括食品中菌落總數、大腸菌群、各種致病菌、霉菌和寄生蟲的檢驗。本

26、篇包括食品中菌落總數和大腸菌群的測定，這兩個項目是每一種出廠食品都必須檢測的項目。實驗五 食品中菌落總數的測定 食品中菌落總數的測定，目的在于了解食品在生產中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況；也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態，確定食品的保存期，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。 食品有可能被多種類群的微生物所污染，每種細菌都有它一定的生理特性，培養時應用不同的營養條件及其生理條件(如溫度、培養時間、PH值、需氧性質等)去滿足其要求，才能分別將各種細菌培養出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法去作菌落總數的測定，所得結果，只包括一群能在營養瓊脂上發育的嗜中溫性需氧

27、菌的菌落數。國家標準所規定的菌落總數(Berobie bacterial count)就是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后，所得1g或lmL檢樣中所合細菌菌落的總數。食品中菌落總數的多少，直接反映著食品的衛生質量。如果食品中菌落總數多于10萬個，就足以引起紹菌性食物中毒；如果人的感官能察覺食品因細菌的繁殖而發生變質時，細菌數大約已達到106一107個g(mL或cm2)。詳見表51。表5-1食品種類菌落總數/個1g或1mL1cm2雞肉108106108.5（極少）牛肉(生)108106.3108.5臘腸106108.5魚106.5106.6蟹肉108貝107牡蠣104105.7鮮蛋奶107

28、冰蛋106.7豆腐105106鮮牛乳106107米飯107108 從表中可以看出食品的變質反映與菌落總數的增多有一定聯系，但有時食品中細菌含量很高，即使已達到相當于同種食品已變質時的細菌數，而食品并未有任何變質現象，這種情況也是經常會遇到的。有時食品遭受污染的程度特別嚴重，食品中雖含有大量的細菌，由于時間短暫或細菌繁殖條件不具備，就見不到變質現象。例如：細菌難以生長的一些干制食品和冰凍食品，它們含有細菌的多少，就可以表明這些食品在生產、運輸、貯藏等過程中衛生管理的狀況。 從食品衛生觀點來看，食品中菌落總數越多，說明食品質量越差，也就應考慮到病原菌污染的可能性愈大；當菌落總數僅少量存在時，則病原

29、菌污染的可能性就會降低，或者幾乎不存在。但也有少數情況并不完全如此，有人曾報道，從市售的一批冰蛋制品中，在所檢出菌落總數在5000個g；以下的樣品中，和其中僅含菌落總數380個g的樣品中，均可分離出沙門氏菌，并且都有大腸菌群存在。再如，在一些菌落總數低的食品中(如罐頭食品)，曾有細菌繁殖并已產生了毒素，但是由于環境條件的限制使細菌不能延續生長繁殖，而毒素因性狀穩定不受環境的影響而仍在食品中保留。保這種情況，就不能單憑菌落總數一項指標來評定食品衛生質量的優劣。 還有一些食品，如酸泡菜、發酵乳等發酵制品，也不能單憑測定菌落總數來確定衛生質量，因為發酵制品本身就是通過微生物的作用而制成的。 根據以上

30、事實，食品中菌落總數的測定對評定食品的新鮮度和衛生質量起著一定的衛生指標作用，但還必須配合大腸菌群的檢驗和病原菌項目的檢驗，才能作出比較全面準確評定。一、目的1、學習并掌握細菌的分離和活菌計數的基本方法和原理2、了解菌落總數測定在對被樣品進行衛生學評價中的意義二、原理菌落總數是指食品經過處理，在一定條件下培養后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數。菌落總數主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。菌落總數并不表示樣品中實際存在的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。三、

31、材料 1、食品檢樣2、培養基和試劑：75乙醇、無菌生理鹽水、15氫氧化鈉溶液、營養瓊脂培養基3、其它設備和材料電熱恒溫培養箱、冰箱（0-4）、恒溫水浴鎢(46士1)、托盤天平、電爐（可調式）、吸管（1mL和10mL）、廣口瓶（500mL）、三角瓶（500mL）、玻璃珠（直徑為5mm）、平皿（皿底直徑為9cm）、試管、試管架、酒精燈、均質器或乳缽、滅菌刀或剪刀、滅菌鑷子、75酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄四、實驗步驟(一)檢驗程序菌落總數檢驗程序見圖51(二)檢樣稀釋及培養 以無菌操作，將檢樣25g(或25mL)剪碎以后，放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預先置適當數量的

32、玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。 固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以8000rmin10000rmln的速度處理1min做成1：10的均勻稀釋液。 用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管劈徐徐注入臺有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液，下同)，振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。 另取1mL的滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。 根據食品衛生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇23個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1

33、mL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。 稀釋液移入平皿后，應及時將涼至46營養瓊脂培養基可放置在(45土1)水浴鍋內保溫注入平皿15mI一20mL，并轉動平皿位混合均勻，同時將營養瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置(36土1)恒溫箱內培養(48土2)h取出板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得Ig(1mL)樣品所含菌落總數。檢樣做成幾個適當倍數的稀釋液選擇23個適宜稀釋度各以1mL之量分別加入滅菌平皿內每皿內加入46適量營養瓊脂菌落計數報告圖5-1(三)菌落計算方法 (1)平板菌落數的選擇 選取菌落數在30一300之間的平板作為菌落總

34、數測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，選取兩個平扳平均數其中一個平板有較大片狀菌落生長時則不宜采用，而應以無片菌落生長的平板計數作為該稀釋度的菌落數。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布2fB均勻，可計算半個平板后乘2U代表整個平皿菌落數。 (2)稀釋度的選擇 應選擇平均菌落數在30一300之間的稀釋度，乘以稀釋倍效，報告之(見表5-2例1)。若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30一300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小應報告其平均數：若比值大于2，則報告其中較小的數字(見表5-2例2、例3)。若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之

35、(見表5-2例4)。若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌范數乘以稀釋倍數報告之(見表5-2例5)。若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告之見表5-2例6。若所有稀釋度的平均菌落數均不在30一300之間，其中一部分大于300或小于30時，近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表5-2例7)。(3)菌落數的報告菌落數在100以剛t1按其實有數報告；大于100時，用二位有效數字，在二位有效數字后面的數字，以四舍五入方法計算。為了縮短數字后面的0的個數，可用10的指數來表示，見表5-2“報告方式”一欄。表5-2 稀釋度的選擇及菌落數據報告方式稀釋液及

36、菌落數兩稀釋液之比菌落總數（個/g，個/mL）報告方式（菌落總數）10-110-210-31多不可計164201640016000或1.6×1042多不可計295461.63775038000或3.8×1043多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計31331300310000或3.1×105527115270270或2.7×1026000<10<107多不可計305123050031000或3.1×104(四)小結 平板培養計數法，只能檢出生長的活菌，不能撿出樣品中全部的細菌數，總是

37、比實際生存在食品中的細菌數要少，這是因為食品中存在多種細菌，它們的生活特性各異，不可能在統一培養條件下全部生長出來。但是，仍能借此評定整個食品被細菌污染的程度，所以目前一般食品的衛生檢驗中都普遍采用這種方法。 平板菌落計數測定食品中的菌落總數，一般均采用中溫培養，特別是已屬于直接供食用的制成食品，因為這些食品衛生的要求，是嚴格防止消化道傳染病病原菌和食物中毒病原菌污染，這些病原菌都屬于嗜溫性菌，因而測定細菌數時，采用中溫培養是比較合理的。四、其他菌落總數的測定方法上節標準平板培養汁數法雖是國家制定的菌落總數測定方法，在一定程度上能反映食品的衛生質量，但是對一些食品卻不能做出準確的評價，這是因為

38、細菌的適應生長的溫度有高溫、中溫和低溫之分，所需的pH值和營養條件也不盡相同，并且和培養時間也有關系。例如，引起新鮮魚類、貝類食品的新鮮度降低以至于腐敗變質，起主要作用的細菌類群是低溫細菌，為了調查這類食品新鮮度的狀況，就必須采取低溫培養72h。又如，冰凍鮮魚、貝類作為食品原料，也常以測定嗜冷細菌的多少，來有效地反映出它們的新鮮度；再如，罐裝食品，就必須以測定嗜熱菌的多少來判定它們的衛生情況，等等。對于這類細菌的培養，所用的時間應相對延長，通常以平板上生長出可見菌落來決定。因為菌落的形成需要一定的時間，如果食品中混雜有多種細菌、菌種之間生長的速度就必然存在著差異，這樣，就希望盡可能使多種細菌都

39、能在平板上產生菌落，從而才能比較正確地反映出食品的衛生質量。培養的時間與培養的溫度有關，在不同的培養溫度范圍內，一般常采用的時間，如表53所示。表5-3 菌落總數測定所采用的時間和溫度培養的細菌培養溫度/培養時間/d嗜溫菌3037（48±3）h嗜冷菌2025575101014嗜熱菌455523五、思考題1、菌落總數的概念。2、測定食品中的菌落總數有什么重要意義?3、詳細論述食品中菌落總數的測定方法。4、怎樣用不同的方法測定活菌制劑中的雙歧扦菌？5、活菌計效法測定食品中的菌落數有何優缺點?實驗六 食品中大腸菌群的測定一、概述(一)大腸菌群的定義及范圍根據國家1994年頒布的食品衛生檢驗

40、方法微生物學部分，大腸菌群(coliform bacteria)系指一群在37、24h能發酵乳糖，產酸、產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群主要是由腸桿菌科中四個菌屬內的一些細菌所組成，即艾希氏菌屆、拘櫞酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬及腸桿菌屬，其生化特性分類見表5-4。表5-4 大腸菌群生化特性分類表靛基質甲基紅V-P拘櫞酸H2S明膠動力44.5乳糖大腸艾希氏菌+/-+大腸艾希氏菌+/-大腸艾希氏菌+/-費勞地拘櫞酸桿菌+/-+/-費勞地拘櫞酸桿菌+/-+/-產氣克雷伯氏菌+產氣克雷伯氏菌+陰溝腸桿菌+/-注：+，表示陽性；，表示陰性；+/-，表示多數陽性，少數陰性。 由上表可以看出

41、，大腸菌群中大腸艾希氏菌I型和型的特點是，對靛基質、甲基紅、v-P和拘櫞酸鹽利用四個生化反應分別為“十十一一”，通常稱為典型大腸桿菌；而其他類大腸桿菌則披稱為非典型大腸桿菌。(二)大腸菌群的測定意義 1、糞便污染的指標細菌 早在1892年，沙爾丁格(Schardinger)氏首先提出大腸桿菌作為水源中病原菌污染的指標菌的意見，因為大腸桿菌是存在于人和動物的腸道內的常見細菌。一年后，塞烏博耳德“斯密斯(TheoboldSmith)氏指出，大腸桿菌因普遍存在于腸道內，若在腸道以外的環境中發現，就可以認為這是由于人或動物的糞便污染造成的；從此，就開始應用大腸桿菌作為水源中糞便污染的指標菌。 據研究發

42、現，成人糞便中的大腸菌群的含量為：108個g一109個g。若水中或食品中發現有大腸菌群，即可證實已被糞便污染，有糞便污染也就有可能有腸道病原菌存在。根據這個理由，就可以認為這種含有大腸菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前為評定食品的衛生質量而進行檢驗時，也都采用大腸菌群或大腸桿菌作為糞便污染的指標細菌。當然，有糞便污染，不一定就有腸道病原菌存在，但即使無病原菌，只要被糞便污染的水或食品，也是不衛生的，不受人喜歡的。 2糞便污染指標菌的選擇 作為理想的糞便污染的指標菌應具備以下幾個特性，才能起到比較正確的指標作用。 存在于腸道內持有的細菌，才能顯示出指標的特異性。 在腸道內占有極高的數量，即

43、使被高度稀釋后，也能被檢出。在腸道以外的環境中，其抵抗力大于腸道致病菌或相似，進入水中不再繁殖。檢驗方法簡便，易于檢出和計數。在食品衛生微生物檢驗中，可作為糞便污染指標菌依據的上述條件，糞便中數量最多的是大腸菌群，而且大腸菌群隨糞便排出體外后，其存活時間與腸道主要致病菌大致相似，在檢驗方法上，也以大腸菌群的檢驗計數簡便易行。因此，我國選用大腸菌群作為糞便污染指標菌是比較適宜的。另外，作為糞便污染的指標細菌還有：分叉桿菌(Bifidobacterium)、擬桿菌(Bacteroides)、乳酸菌、腸桿菌科中的梭狀芽胞和底群鏈球菌等，據報道，擬桿菌是人體腸道內第二個較大的菌群；厭氣性乳酸菌占人體腸

44、道內細菌組分的50以上，一般糞便中該菌量為109個g1010個g。腸道內屬于腸桿菌科的細菌，除上述的細菌外，還有克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌和副大腸桿菌等，也可以充當糞便污染指標菌。很多研究者認為，在冷蹤食品或冷凍狀態照射處理過的食品中，大腸桿菌可比其他多種病原菌容易死亡，因此，像這類食品，用大腸菌群作為指標菌就不夠理想，而底群鏈球菌對低溫抵抗力強，作為這類食品的糞便污染指標菌就比較適宜。上述的這些腸道內的其他細菌，雖與糞便有關，因均比不上大腸菌群所具備的指標特異性，所以目前還沒有列入作為公認的糞便污染的指標細菌。當然，大腸菌群作為糞便污染指標菌也有一些不足之處：飲用水中含有

45、較少量大腸菌群的情況下，有時仍能引起腸道傳染病的流行。大腸菌群在一定條件下能在水中生長繁殖。在外界環境中，有的沙門氏菌比大腸菌群更有耐受力。3大腸菌群作為糞便污染指標菌的意義糞便污染的食品，往往是腸道傳染病發生的主要原因，因此檢查食品中有無腸道菌，這對控制腸道傳染病的發生和流行，具有十分重要的意義。許多研究者的調查證明，人、畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。在腹瀉患者所排糞便中，非典型大腸桿菌常有增多趨勢，這可能與機體腸道發生紊亂，大腸菌群在型別組成的比例上因而發生改變所致；隨糞便排至外環境中的典型大腸桿菌，也可因條件的改變。使生化性狀發生變異，因而轉變為非典型大腸桿菌。

46、由此看來，大腸菌群無論；莊糞便內還是在外環境中，都是作為一個整體而存在的，它的菌型組成往往是多種的，只是在比例上，因條件不同而有差異。因此，大腸菌群的檢出，不僅反映校樣被糞便污染總的情況，而且在一定程度上也反映了食品在生產加工、運輸、保存等過程中的衛生狀況，所以具有廣泛的衛生學意義。由于大腸菌群作為糞便污染指標菌而被列入食品衛生微生物學常規檢驗項目，如果食品中大腸菌群超過規定的限量，則表示該食品有被糞便污染的可能，而糞便如果是來自腸道致病菌者或者腹瀉患者，該食品即有可能污染腸道致病菌。所以，凡是大腸菌群數超過規定限量的食品，即可確定其衛生學上是不合格的，該食品食用是不安全的。二、實驗目的1、了

47、解大腸菌群在食品衛生檢驗中的意義。2、學習并掌握大腸菌群的檢驗方法。三、原理大腸菌群系指一群能發酵乳糖，產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，具有廣泛的衛生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數系以每100g（或ml）檢樣內大腸菌群最近似數（the most probable number 簡稱MPN）表示。三、材料1、樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發酵調味品或其他食品。 2、菌種大腸埃希氏菌（Escherichia coli）產氣腸桿菌（Entero

48、bacteria aerogenes）3、培養基及試劑單料乳糖膽鹽發酵管、雙料乳糖膽鹽發酵管、乳糖膽鹽發酵管、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液、蛋白陳水、靛基質試劑、麥康凱(MA)4、其它設備和材料 溫箱(36土1)、水浴鍋(44土0.5)、天平、顯微鏡、均質器或乳缽、溫度計、平皿、試管、發酵管、吸管、載玻片、接種針。四、實驗步驟(一)檢驗程序大腸菌群檢驗程序見圖52(二)操作步驟1采樣及稀釋以無菌操作將校樣25g(或25mL)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質器

49、，以800rmjn1000rmin的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。根據食品衛生要求或對檢驗樣品污染情況的估計按種3管。也可直接用樣品接種。2乳糖初發酵試驗即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發酵乳糖產生氣體的細菌。將待校樣品接種子乳糖服鹽發酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管1mL及1mL以下者，用單料乳糖發酵管。每一個稀釋度接種3管，置(36土1)培養箱內，培養(24土2)h，的

50、所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，勿有產生者，則按下列程序進行。如有產生者，則按下列程序進行。3分離培養將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置(36土1)溫箱內，培養18h一24h，：然后取出，觀察菌落形態并作革蘭氏染色鏡檢和復發酵試驗。4乳糖復發酵試驗即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酪管試驗呈陽性反應的試管內分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發酵乳糖產生氣體。在上述的選擇性培養基上，挑取可疑大腸菌群12個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置(36士l)的溫箱內培養(24土2)h，觀察產氣情況。檢樣稀釋乳糖膽鹽發酵管36±1，24±2h產氣不產氣伊紅美藍瓊脂平板36±1，18-24h大腸桿菌陰性報告乳糖發酵管36&#