1、基因克隆DNA克隆是指在體外將目的基因或 DNA片段同能夠自我復制的載體 DNA 連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過 程，乂稱為重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的 DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞 技術和重組子篩選技術等。一 DNA的提取二目的DNA片段的獲得（酶切）三體外重組1 LB培養基的配制2大腸桿菌感受態細胞的制備3載體的選擇四導入受體細胞五重組子的篩選1插入失活法實驗一 DNA提取取0.5克以下的魚類組織或20ul血液：1準備1.5ml離心管，加入500ul裂解液，取組織放入離心管，破

2、碎。（常溫操作） 2恒溫箱裂解，55C。30min。3加等體積Tris飽和酚（酚：氯仿：異戊醇25: 24: 1）,先顛倒混勻后靜置抽提 10分鐘，離心4度12000g 10分鐘。（注意酚在油層下面）4取上¥青（把槍頭去掉部分，注意液面。蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA立于上層水相中），加入等體積 CI（氯仿：異戊醇24: 1）,先顛倒混勻后靜置抽提 10 分鐘，離心4度12000g 10分鐘。5匯集上活，加2倍無水乙醇（-30度保存），顛倒混勻可觀察到絮狀 DNA。在-30 度冰箱沉淀30min。離心4度12000g 10分鐘。6棄去上活,75%乙醇洗滌,7500g離心5

3、分鐘。7重復一次上述操作。7在無菌臺十燥半小時，乙醇揮發。8 溶解于 200ulddwater。9 切 DNA。裂解液的配制1ml體系200ul0.5M EDTA （ PH=8.0高壓滅菌。作用抑制酶的活性。螯合DNA酶發揮作用需要的金屬離子。50ul10%SDS （蛋白質變性劑）10ul1MTris-cl（PH=8.0高際菌）緩沖溶液5ulPK （消化）735ul滅菌超純水EDTA（0.5 M , pH8.0）將186.1 g 二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na.2H2。加入800ml水中，在磁 力攪拌器上劇烈攪拌。用NaOF節pH值至8.0 （約需20g NaO腳粒），定容至1L 分裝后

4、高壓蒸汽滅菌。EDTAC鈉鹽加入NaOH務溶液的pH值調至接近8.0時， 才會溶解。實驗二 目的DNA片段的獲得（酶切）獲得了包含目的基因在內的 DNA，這些DNA或來自于目的生物基因組 DNA 或來自目的細胞 mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA。由于基因組DNA較大,不 利于克隆，必須將其處理成適合克隆的 DNA小片段，常用的方法是核酸限制性 內切酶消化。儀器：臺式離心機、恒溫水浴、取液器、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀試劑EcoR I ,Hind mW,DNA 樣品（濃度 >0.3 g/ X 1X TAE 緩沖液。操作（一）EcoR I單酶切。1,取1支十凈、火菌新Eppendof 1言

5、，分別按卜表加入（ul）滅菌水13EcoR I緩沖液2DNA43ugEcoR I110U20ul體系。2 , 37C保溫1 4小時，也可過夜。3, 保溫結束后65-70 C 10min滅活酶（如為熱穩定性酶，則用氯仿抽提）。4, 取10 應右的反應液加入1 1電泳加樣緩沖液，電泳。目的片段回收。注意：1 ,樣品加入次序為水、緩沖液、 DNA最后為酶，不應顛倒。2 ,加酶步驟要在冰浴中進行，在加酶前應先將水、緩沖液及待切DNA混勻。3 ,反應體系的體積要盡量少，要保證所加酶的體積不高于總體積的1/10。4, 為了控制反應體積和促進反應進行，要求 棋板DNA的濃度應很高,因此如 底物DNA濃度過低

6、則應進行真空濃縮。實驗三 LB培養基的配制LB培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基。含有酵母提取物、蛋白豚和NaCL其中酵母提取物為微生物提供碳源、能源和磷酸鹽，蛋白豚主 要提供氮源，NaCl提供無機鹽。在配制固體培養基時還要加入一定量瓊脂作凝 固劑。瓊脂在常用濃度下96C時溶化。瓊脂在40C時凝固（高壓滅菌融化瓊脂 糖），通常不被微生物分解利用。固體培養基中瓊脂的含量根據瓊脂的質量和氣 溫不同而有所不同。LB培養基用來培養細菌，將其pH調至中性或微堿性，利丁細菌生長繁殖。器材和試劑酵母提取物，蛋白豚，NaCl，瓊脂，氨節宵霉素（Amp）; 1mol/L NaOH; 錐形瓶，燒杯，量

7、筒，玻璃棒，細菌培養血，培養基分裝器，天平，牛角匙，高 壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙，記號筆，紗布，封口膠。1000ml體系LB液體培養基：參考分子克隆實驗指南在950 ml去離子水中加入：胰化蛋白豚（bacto-typtone）10g ,酵母提取物（bacto-yeast extract）5g ,NaCl10g搖動容器直至溶質溶解.用1mol/LNaOH （大約1ml ）調pH至7.4.（適合E.coli的生長） 用去離子水定容至 1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌 20min.（全過程需要2小時）錫箔。常溫保存。 氨節宵霉素（Amp），用無菌水配制成50mg/mL容液，置-20 C冰箱保存。LB固

8、體培養基1L和液體一樣，加15g瓊脂粉。1 .稱量 按培養基配方比例依次準確地稱取酵母提取物 5g、蛋白豚10g、NaCl 10g. 放入燒杯中。蛋白豚很易吸潮，在稱取時動作要迅速。2在燒杯中加入950 ml去離子水，搖動容器直至溶質溶解.用1mol/LNaOH（800ul ）調pH至7.4，再用去離子水定容至1L。轉移到試劑瓶中再加入加15g瓊脂粉。高壓滅菌。2. 抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養基溫度降到55 C時（手可觸摸）在 超凈臺加入1/500體積50mg/ml抗生素，以免溫度過高導致抗生素失效，并 充分搖勻。一定要在溫度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（類似瓊脂糖制膠）3. 倒板：

9、一般10ml倒1個板子。培養基倒入培養皿后，打開蓋子，在紫外 下照10-15分鐘。4. 保存：用封口膠封邊，并倒置放丁 4C保存，一個月內使用。1kg=1000g1g=1000mg1mg=1000ug1ug=1000ng本實驗使用克隆載體質粒是 PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR試驗四 大腸桿困感受態細胞的制備（超凈臺）細菌處于容易吸收外源DN則狀態叫感受態。轉化（Transformation ）是指 質粒DN威以它為載體的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0C, CaC2 低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DN彤成抗DN/B的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經42C短

10、時間熱擊處理，促進細胞吸收 DN®合物。 將細菌放置在非選擇性液體培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新表型得到表達，然后將此細菌培養物涂在含氨節宵霉素的選擇性固體培養基上?！緝x器、材料與試劑】（一）儀器1. 超凈UK作臺2 .低溫4C離心機 3 .恒溫搖床37C 180rpm/min4. -80C冰箱5 .恒溫水浴器（二）材料1. 氯化鈣（CaClJ 2.LB培養基（液體）3大腸桿菌DH5a（kit ） 4. 50m噂心管5. 吸嘴、小指管6 .試管、培養皿、錐形瓶等（三）試劑1. 0.05 mol/L CaCl 2溶液（分子量110.98 ） 滅菌后4C保存。2. 氨節宵

11、霉素（Amp），用無菌水配制成50mg/m溶液，置-20 C冰箱保存。3. LB液體培養基。大腸桿菌感受態細胞的制備1. 從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落接于含有5 mL LB液體培養基的試管中，37 C。180rpm/min振蕩培養過夜。2. 取5 mL菌液轉接到一個含有100 mL LB液體培養基1000ml錐形瓶中,37C 180rpm/min 振蕩培養 90min。3. 舟菌液轉移到冰預冷 的50 mL離心管中，冰上放置10 min。4. 4C,離心 10 min（4 000 r/min） ,回收細胞。5. 倒出培養液，將管倒置1 min以便培養液流盡。6. 用冰冷的0.05 mol/L

12、 CaCl 2 20mlS浮沉淀，立即放在冰上保溫10 min。7. 4 C 4 000 r/min ，離心 10 min,回收細胞。8. 用冰冷的2 mL 0.05mol/L CaCl 2懸浮細胞（務必放冰上）。加入甘油至終濃度為 15%;9. 使用1.5ml離心管分裝細胞，每200 ul 一份。此細胞為感受態細胞。-80 C保 存備用。本實驗使用生物公司感受態大腸桿菌 DH5a載體的選擇基因工程的載體應具有一些基本的性質：1） 在宿主細胞中有獨立的復制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片 段得以擴增。2）分子量盡可能小，以利丁在宿主細胞中有較多的拷貝，便丁結合更大的外源 DNA片段。

13、同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因 Amp）,以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。4） 載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限 制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位丁檢測表型 的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利丁重組子的篩選。（藍白斑法）DNA克隆常用的載體有：質粒載體（plasmid ），噬菌體載體（phage）, 柯斯質粒載體（cosimid ），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載 體（phagemid ）及酵母人工染色體

14、（YAC）等。從總體上講，根據載體的使用 目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。SP6灣pnlvalmal嵩削蜥 E s K A s B X s A H p s Hrttast1551136289。846 9PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 酶切位點及復制起始點本實驗使用克隆載體質粒是 PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR產品介紹:產品規格目錄號數量價格元pGEMS-3Zf-J 'ector20ngP2271I6S1pGEMt-3ZS- V-tct20|4gP22611649說明:pGEMS -SZz-：SpGEME -義土：由pGE、："

15、;王載 1$衍生而來，含有絲狀噬菌體七的復制起點-載體上的乳瞎吾酶的如肱 漏碼區中有多克隆位點，多克隆位點旁邊還含有SPfT-RN合 酶啟動子二-選用合適的E.cot®株:比如冷，就能通過藍白篩 選的方法把s肱插入失活的重狙克隆直接簽別出來b多克隆位點區 域含有一些單一的限制性位點,如EeRI腮二KpiC. Aval. 5： Bam?£L Xbal: Sail, AccL 臭用互 Psi：邱K以及WndUL pGE低- SZfL和pGEWNZf(-載體除了fl起點的方向外，RE都是一樣的- 因此可以作為標準克隆載體、體外轉錄的模板，也可用于制備環化 ssDNA,特點藍白弗選

16、:能方便地鑒定重擔克隆.逋用:此載體能用于標準克隆，單健DNA制備以及在與多克隆區 _域相度的$是和廠RN；添合酶啟動子的作用下進仃體外轉錄.方便:多克隆區域的且有多種限制性內切酶位點,在克隆時可選一 _擇多種限常勝酶。操作手冊編號pGEMgGZft-) Vkioi T«hnical Bulleciii TB0S6 pGEM®*jZft-) Vector ThnKal Bullerm TB045 借存條件:載體信存于-253 ,細菌菌株儲存于-FSGenBankS EMBL Acce:sten Xumbeiv+X切笥X653GL實驗五 體外重組體外重組即體外將目的片斷和載體

17、分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶切割載體的多克隆位點便可 獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成 重組體，此為粘末端連接。當目的 DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體 相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。外源DN用載體分子的連接就是DN項組，重新組合的DNAH重組子。重組的 .一，* ，2+一 、一 一.一一DN疥子是在DN錐接酶的作用下，有Mg、AT的在的連接緩沖系統中，將分別經 酶切的載體分子與外源DN疥子進行連接。DN錐接酶有兩種：T4噬菌體DNA!接 酶和大腸桿菌DN施接酶。兩種DN施

18、接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的 DN疥 子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA!接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特 性，使兩個平末端的雙鏈DN疥子連接起來。T4噬菌體DN施接酶催化DN施接反應分為3步：首先，T4 DNA1接酶與輔助 因子AT所成酶-AM度合物；然后，酶-AM由合物再結合到具有5'-磷酸基和3' -羥基切口的DN麻.使DNM苜化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起 來。連接反應的溫度在37°時有利于連接酶的活性。但在這個溫度下，粘性末端 的氫鍵結合是不穩定的。實驗溫度選擇在12-16 C，連接12-16 h（過夜），既可最 大限度地發揮連接酶的活

19、性，乂兼顧到短暫配對結構的穩定。重組質粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進行篩選鑒定。利用a互補現象 進行篩選是最常用的一種鑒定方法。載體具有一段大腸桿菌6半乳糖苜酶的啟動 子及其編碼肽鏈的DN臨歹0，此結構稱為lacZ '基因。lacZ '基因編碼的a肽 鏈是6半乳糖苜酶的氨基端的短片段（146個氨基酸）。宿主和質粒編碼的片段各 自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補的機制形成具有功能活性的6半乳糖苜酶分子。lacZ'基因編碼的a肽鏈與失去了正常氨基端的6半乳糖苜酶突變 體互補，這種現象稱為a互補。由a互補而形成的有功能活性的6半乳糖苜酶， 可以用X-gal （5-漠

20、-4-氯-3-呵噪-6 -D-半乳糖苜）顯色測定出來，它能將無色的 化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的底物5-漠-4-靛藍。因此，任何攜帶著lacZ' 基因的質粒載體轉化了染色體基因組存在著此種6半乳糖苜酶突變的大腸桿菌細胞后，便會產生出有功能活性的6半乳糖苜酶，在IPIG（異丙基硫代6-D-半乳 糖苜）誘導后，在含有X-gal的培養基平板上形成藍色菌落。而當有外源 DNA段 插入到位于lacZ'中的多克隆位點后，就會破壞a肽鏈的ORF從而不能合成與受 體菌內突變的6半乳糖苜酶相互補的活性a肽，而導致不能形成有功能活性的6 半乳糖苜酶，含有重組質粒載體的克隆是白色菌落。（一

21、）設備1 .恒溫搖床2 .恒溫水浴器3 .恒溫培養箱4 .臺式離心機5 .低溫離心機（二）材料I. 胰蛋白月東2 .酵母提取物3 .氯化鈉（NaCl） 4 .氨節宵霉素5 .氯化鈣（CaC）6. 二甲基甲酰胺7 .限制性內切酶8 . T4 DN礎接酶9 .大腸桿菌II. PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 12 .培養也 13 .接種針 14.玻璃涂棒15 .試管16 .灑精燈17 .鑲子、牙簽等（三）試劑1. 3 mol/L KAc（pH 5.2） （分子量98.14）高壓滅菌，常溫保存。2. X-gal :將X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20 mg/mL,不需過濾滅菌，分裝小 包

22、裝，避光貯存于-20 C。3. IPTG:取2 g IPTG溶于8 mLM蒸水中，再用雙蒸水補至10 mL用0.22 濾膜 過濾除菌，每份1 mL,貯存于-20C。（一）質粒 DNA勺制備：PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR。（二）制備重組DNA1. 在滅菌的Eppendorf管中，質粒酶切。2. 在另一無菌Eppendorf管中，全基因組酶切。3. 反應完畢后各取2酶解液做電泳分析。基因組做膠回收。-20 C保存。4. 余下的質粒酶解液加入1/10體積的3 mol/L KAc（pH 5.2）溶液，再加2倍體積的 無水乙醇（-20C保存），-20 C冰箱，2h （沉淀DNA） 12 000 r/min 4 C離心15 min,棄上活，加常溫70®洗沉淀物，再離心，去上活，真空十燥后，加 50 11 L滅菌水。連接試驗20ul體系超凈水 7酶切質粒5酶切DNA 510XBuffer 2T4 DN礎接酶 1PC故上14 C過夜。在瓊脂糖上觀察連接產物,對照組是質粒酶切產物和基因組酶切產物。實驗六轉化實驗載體DNA