1、雞球蟲dna疫苗研究進(jìn)展摘要：雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的-種寄生蟲病。一直以來,雞球蟲病主要依靠藥物來進(jìn) 行防制。但是，隨著球蟲抗藥性問題的日益嚴(yán)重、抗球蟲新約開發(fā)困難及人們對食品安全的 關(guān)注，藥物在球蟲病控制屮的作用越來越受到限制，因而人們期望用更好的手段來控制雞球 蟲病。dna疫苗是近年發(fā)展起來的-種新型疫苗，因其安全、穩(wěn)定、高效和易于制備而得到 廣泛研究。隨著雞球蟲保護(hù)性抗原基因的不斷發(fā)現(xiàn)，以及對細(xì)胞因子等免疫佐劑在抗球蟲感 染中的作川不斷深入探索，雞球蟲dna疫苗的研究引起人們的廣泛關(guān)注和極大興趣。木文就 雞球蟲d譏疫苗作丿ij機(jī)理、抗原基因、載休、免疫佐劑、免疫途徑、免疫劑量、免疫程

2、序及 dna疫苗研究進(jìn)展方面展開一系列論述。關(guān)鍵詞：dna疫苗；球蟲；雞雞球蟲病(coccidiosis )是由艾美爾屬(eimeria)的球蟲引起的 寄生原蟲病。全世界報(bào)道的雞球蟲有9種，但為世界所公認(rèn)的有7種: 柔嫩艾美爾球蟲(e. tenella)、巨型艾美爾球蟲(e. maxima)、 堆型艾美爾球蟲(e. acervulina)、毒害艾美爾球蟲(e. necatrix)、和緩艾美爾球蟲(e. mitis)、早熟艾美爾球蟲(e. praecox)、布氏艾美爾球蟲(e. brunetti)。以e tenella、e. maxi ma > e accrvulina> e nec

3、atrix、 e brunetti 最為'常見,x'j' 雞的致病力也較強(qiáng)。雛雞感染球蟲后，大量腸上皮細(xì)胞受損、出血， 嚴(yán)重者造成死亡。集約化養(yǎng)雞場是球蟲暴發(fā)的主要場所，其發(fā)病率高 達(dá)50%70%,死亡率為20%30%,嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)80%,對養(yǎng) 雞業(yè)的危害嚴(yán)重。病愈的雛雞，生長發(fā)育受阻，長期不能康復(fù)；成年 雞多為帶蟲者，其增重和產(chǎn)蛋受到一定的影響，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大 損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界養(yǎng)雞業(yè)因球蟲病造成的損失大約為30億美元。 目前防治球蟲病的手段主要依賴于藥物，據(jù)報(bào)道從2000年起，僅英 國每年抗球蟲纟勺物的使用就超過230 to由于任何一種抗球蟲藥物在 使用一

4、段時(shí)間后都會(huì)出現(xiàn)球蟲抗藥性問題，這給雞球蟲病的防治帶來 很人困難。盡管交替使用不同的抗球蟲藥物能改善抗藥性，但這種改 善并不能持久。球蟲藥物耐藥性的產(chǎn)生、研制新藥費(fèi)用之高以及人們 對藥物殘留的日益關(guān)注和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，迫切期望找到更好的 雞球蟲防治手段。傳統(tǒng)的強(qiáng)毒苗、弱毒苗預(yù)防雞球蟲病因存在安全性 差，免疫效果不理想等因素而得不到廣泛應(yīng)用；球蟲基因工程疫苗是 較為理想的疫苗，但免疫保護(hù)效果較差。dna疫苗是近年發(fā)展起來的 一項(xiàng)新的生物技術(shù)，它是將編碼抗原蛋口的外源基因d7a克隆到真核 質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組質(zhì)粒dna直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源 基因通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，激

5、活機(jī)體的免疫系統(tǒng)， 進(jìn)而引發(fā)免疫反應(yīng)。1 dna疫苗免疫的作用機(jī)理1990年，wolff等 將dna重組表達(dá)載體注入小鼠的骨骼肌中，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)載體上的基 因在局部肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且產(chǎn)生了抗體，這偶然發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致dna疫苗 的誕生。隨后，dna疫苗的研究得到了飛速發(fā)展。耳前，dna疫苗在 宿主體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫機(jī)制雖不十分清楚，但研究表明，dna質(zhì)粒被導(dǎo) 入宿主細(xì)胞后，病原體抗原的基因片段在宿主細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)并合成 抗原，再經(jīng)過加工、處理、修飾遞呈給免疫系統(tǒng)，可以引發(fā)全面的免 疫應(yīng)答反應(yīng)。dna疫苗接種機(jī)體后，質(zhì)粒被周圍的組織細(xì)胞（如肌細(xì) 胞）、抗原遞呈細(xì)胞（apc）或其他炎性細(xì)胞攝取，被吸收的質(zhì)粒在

6、機(jī)體啟動(dòng)子作用下合成mrna,并被細(xì)胞質(zhì)中的酶復(fù)合物-蛋白酶體所 降解，形成氨基酸肽段，然后經(jīng)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（tap）轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 腔進(jìn)一步修飾成氨基酸短肽。這些短肽（抗原表位）片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔 與新合成的miic- i分子的抗原結(jié)合槽和結(jié)合，形成抗原肽-miic- i分 子復(fù)合物，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表而作為免疫原信號(hào)肽供cd84-ctl所識(shí)別， 導(dǎo)致其活化、增值并分化為具有殺傷能力的效應(yīng)ctl (to),誘導(dǎo)產(chǎn) 生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。另一部分蛋白抗原從分泌它們的抗原遞呈細(xì) 胞(apc)的細(xì)胞膜上進(jìn)入mhc-ii類型途徑，dna疫苗基因表達(dá)的抗 原蛋白未經(jīng)加工被釋放出去由專職的apc攝取后，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過

7、吞噬 體和溶酶體作用后被降解成具有抗原特異性的多肽，這些多肽同細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)工的mhc- ii分了相結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，被輔助性t細(xì)胞 cd4+ th細(xì)胞的受體識(shí)別。th細(xì)胞分泌淋巴因子，刺激b細(xì)胞轉(zhuǎn)化 為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)了抗原特異型的體液免疫應(yīng)答。2影響雞球蟲dna疫苗免疫效果的因素2. 1制備雞球蟲dna疫苗的抗原基因隨著分了生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，近年來，研究人員用不同的方法鑒 定出了一些球蟲抗原基因，比如通過建立表達(dá)性dna文庫或cdna艾 庫，用抗體篩選球蟲抗原基因；或者用抗球蟲不同階段的多克隆抗體 篩選球蟲抗原基因；還有些研究者通過建立球蟲dna文庫或cdna文 庫后，用標(biāo)記

8、的特異性寡聚核昔酸作探針，或用標(biāo)記球蟲本身的rna、 cdna或dna作探針來篩選球蟲抗原基因，這些t作為研制可提供保 護(hù)力的球蟲dna疫苗打下基礎(chǔ)。研究顯示，雞球蟲在子抱子和裂殖生 殖階段具有良好的免疫原性，對誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答至關(guān)重 要。目前克隆出來的子砲子和裂殖生殖階段良好的免疫保護(hù)性抗原基 因有表面抗原基因ta4、na4、3-ie、mz5-7、ldh、5401、csz-1,細(xì) 胞器抗原基因折光體蛋口基因s07和etla基因、微線蛋口基因etmic-1、etmic-2、etmic3、etmic-4、etmic-5 和emtfp250、以及 q-微管蛋白基因l8-10 o這些基因編

9、碼的抗原蛋白都具有良好的 免疫原性，為雞球蟲dna疫苗的研究奠定了重耍的基礎(chǔ)。2. 2載體dna疫苗載體質(zhì)粒作為編碼抗原目的基因表達(dá)抗原的工具，其組成與 結(jié)構(gòu)特征對dna疫苗免疫原性有顯著影響。用作dna疫苗的載體必須 具備以下特點(diǎn)：在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)能高水平地表達(dá)目的基因；本身不復(fù) 制；不會(huì)整合到宿主染色體中。dna疫苗研究中常用的質(zhì)粒載體包括 真核表達(dá)載體如psv2、prsv、pcdna31、pci和pvaxl等。pvaxl載 體來源于pcdna3. 1載體，經(jīng)過改造專門為開發(fā)dna疫苗所設(shè)計(jì)，符 合美國fda于1996年12月22日公布的關(guān)于用于預(yù)防感染性疾病 dna疫苗指導(dǎo)規(guī)范的有關(guān)要求，是

10、目前認(rèn)為較為安全的疫苗載體。2. 3免疫佐劑2. 3. 1細(xì)胞因子近年來，關(guān)于細(xì)胞因子研究的報(bào)道比較多，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子在抗球蟲 感染中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞因子有多種，國內(nèi)外在球蟲dna疫苗 應(yīng)用研究比較多的是口細(xì)胞介素-2 ( il-2)和干擾素-y ( ifn- y)o il-2是細(xì)胞免疫中主要的細(xì)胞因子，lithl細(xì)胞產(chǎn)生及部分b 細(xì)胞產(chǎn)生，可對多種有絲分裂原或抗原包括寄生于細(xì)胞內(nèi)的艾美爾球 蟲或子抱子等產(chǎn)生反應(yīng)。il-2可誘導(dǎo)t和b細(xì)胞增值分化，促進(jìn)細(xì) 胞毒性t細(xì)胞的前提細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性t細(xì)胞，并增強(qiáng)其殺傷效 應(yīng)，并可促進(jìn)nk細(xì)胞功能及釋放干擾素。因?yàn)榧?xì)胞免疫在球蟲免疫 中占有十分重

11、要的地位，許多學(xué)者對雞il-2在雞球蟲病中的作用進(jìn) 行了 研究。我國學(xué)者李祥瑞首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)克隆系統(tǒng)屮克隆出雞 tl-2 cdna后,開創(chuàng)了雞il-2的應(yīng)用研究。l訂lehoj等報(bào)道，在 e. tenella或eacervulina感染雞的前1 d或感染后的1 d,用cona 刺激雞淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子il-2處理雞，可以明顯降低球蟲感 染雞卵囊的排出量，從而證實(shí)了 il-2在抗etenella和e acervulina感染中發(fā)揮作用。李宏梅等研究了雞重組11>-2對球蟲感 染雛雞細(xì)胞免疫的影響，用真核細(xì)胞表達(dá)的重組雞il-2處理接種球 蟲的雞，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，與感染對照

12、組相比，重組雞il-2處 理過的雞脾臟和盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著增高，說明重組雞 il-2可以消除球蟲感染引起的免疫抑制。謝昆等研究了重組雞il-2 蛋白的抗球蟲作用，分別肌肉注射14日齡和21日齡雞重組il-2蛋 口，1周后感染球蟲卵囊，測定抗球蟲指數(shù)。結(jié)果表明，重組雞il-2 蛋白能減低相對卵囊產(chǎn)量、減少盲腸病變、提高相對增重。choi等 用eacervulina感染雞，測定脾臟和十二指腸!l-2mrna轉(zhuǎn)錄水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在初次感染和再次感染后，試驗(yàn)組il-2 mrna水平都顯著 提高。garcia等報(bào)道感染第3天和第5天給雞注射il-2可使卵囊排 出量減少。ifn-y是具有抗病毒

13、、影響細(xì)胞生長和分化、調(diào)節(jié)免疫 反應(yīng)等生物活性的蛋白質(zhì)。雞ifn-y主要由活化t細(xì)胞和nk細(xì)胞產(chǎn) 生，其主要功能為促進(jìn)mhcii分子表達(dá)和抗原提呈，誘導(dǎo)tho細(xì)胞向 thl細(xì)胞分化而抑制向th2細(xì)胞分化，刺激nk細(xì)胞并增強(qiáng)其殺傷功 能，促進(jìn)口噬細(xì)胞吞噬功能以及t、b細(xì)胞分化和細(xì)胞毒性t細(xì)胞成 熟，刺激b細(xì)胞分泌抗體，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能olillehoj和choi 通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重組雞ifn-y可顯著抑制球蟲卵囊 的發(fā)育和感染球蟲引起的體重減輕。葉秀華等對重組雞ifn-y抗球 蟲作用進(jìn)行了初步研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，重組雞ifn-y對于減輕球 蟲感染所造成的生長性能下降、減少卵囊排岀

14、量和腸道病變計(jì)分有一 定的效果。此外，葉秀華等還對重組雞ifn-y對雞體抗球蟲細(xì)胞免 疫的作用進(jìn)行了研究，通過測定重組ifn-y處理組雞的各項(xiàng)免疫指 標(biāo)，比如淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，脾臟和盲腸扁桃體的t淋巴細(xì)胞數(shù)量等, 表明重組雞ifn-y可顯著提高雞體抗球蟲保護(hù)性細(xì)胞免疫水平。雞 ifn-y的產(chǎn)生水平已經(jīng)被用于衡量雞體對球蟲抗原的t細(xì)胞反應(yīng)標(biāo) 準(zhǔn)。從以上可以看出，細(xì)胞因了的作用不可忽視。而且人們已經(jīng)將目 光投向利用細(xì)胞因子來治療球蟲病，目前在研究dna疫苗時(shí)也克隆插 入某種細(xì)胞因子基因構(gòu)建出免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗來提高疫苗保護(hù)效 果，這也為防治球蟲病開辟了新途徑。2. 3. 2質(zhì)粒dna骨架中非甲基

15、化的cpg序列dna疫苗中質(zhì)粒dna具 有顯著的佐劑作用，佐劑的作用依賴于質(zhì)粒dna存在的非甲基化cpg 的免疫刺激序列（iss） o現(xiàn)已證明iss中若含一段cpg序列，則增強(qiáng) 刺激作用。這種免疫刺激作用僅見丁細(xì)菌dna,而在脊椎動(dòng)物dna則 缺乏，可能與細(xì)菌比脊椎動(dòng)物dna有較多的cpg序列頻率有關(guān)。含cpg 序列的i）na具有激活多種免疫細(xì)胞，誘生多種細(xì)胞因子如兒t2、 il-18和ifn-x,尤其可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向thl型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換，具有 明顯的免疫佐劑效應(yīng)。徐前明等采用細(xì)菌cpg dna作雞球蟲弱毒苗 immueox佐劑以探索其應(yīng)用可行性。將制備的細(xì)菌cpg dna和球蟲疫 苗immu

16、eox單獨(dú)或聯(lián)合免疫接種雞，分別觀察肓腸病變計(jì)分、opg和 體增重情況。結(jié)果表明用細(xì)菌cpg dna作雞球蟲弱毒苗immueox的佐 劑可提高該疫苗免疫保護(hù)效果，抗球蟲綜合指數(shù)達(dá)到172。2. 4免疫途徑、免疫劑量和免疫程序不同的免疫途徑不僅會(huì)影響d7a 疫苗激發(fā)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，而且也會(huì)影響免疫應(yīng)答的類型。進(jìn)行dna 疫苗免疫時(shí)，通常都是將純化的裸dna質(zhì)粒鹽溶液直接注射入宿主體 內(nèi)，而肌肉注射是導(dǎo)入dm疫苗的一種簡便而有效的方法。免疫反應(yīng) 的強(qiáng)度與免疫劑量呈止相關(guān)，當(dāng)用50 100 ug劑量進(jìn)行肌肉注 射免疫時(shí)可獲得較好的免疫效果，當(dāng)用較大劑量時(shí)，免疫效果反而下 降。song等對dna疫苗的

17、免疫途徑、免疫劑量、免疫程序以及dna疫 苗的穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果顯示：不同的免疫途徑包括 皮下注射、口服、靜脈注射、肌肉注射、滴鼻點(diǎn)眼，其中腿部肌肉注 射所產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果最好;在設(shè)置的4個(gè)劑量組200 ug> 100 u g、50 ii g、25 ug中，25 ug是免疫保護(hù)效果最好的劑量組；在制 定免疫程序時(shí)，1周齡首免組比2周齡首免組效果好、加強(qiáng)免疫組與 非加強(qiáng)免疫組效果差別不大、1周齡首免2周齡加強(qiáng)免疫組效果最好; 而將dna疫苗在不同溫度（一20 °c、4 °c和室溫）下分別保存1個(gè) 月、3個(gè)月及6個(gè)月進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)研究中，dna疫苗在6

18、個(gè)月內(nèi)受溫度和保存期影響較小。3雞球蟲dna疫苗研究現(xiàn)狀 雞球蟲dna疫苗是將編碼球蟲保護(hù)性抗原的基因直接與dma表達(dá)載 體連接，構(gòu)建重組dna表達(dá)質(zhì)粒，直接用此重組質(zhì)粒免疫雞，在雞體 內(nèi)直接表達(dá)具有免疫原性的蛋白抗原基因，這種體內(nèi)表達(dá)的蛋白與原 核表達(dá)的蛋白相比較能夠形成止確的折疊，包括翻譯后加工修飾過 程，更接近其天然構(gòu)象，能被免疫系統(tǒng)識(shí)別從而達(dá)到免疫保護(hù)效果。 吳紹強(qiáng)等將etenella bj株保護(hù)性抗原基因ta4與etm基因串聯(lián) 后插入到dna疫苗載體pcdna3. 1中，然后用重組質(zhì)粒免疫雞，結(jié)果 表明，50 pg的質(zhì)粒dna就能產(chǎn)生良好的免疫效果，可刺激t淋巴 細(xì)胞增值，產(chǎn)生免疫保

19、護(hù)，抗球蟲指數(shù)（aci）在160以上。du等將 e. tenella zj株5401基因構(gòu)建dna疫苗pcdna3. 1-5401,以致弱沙 門氏菌作為載體進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用減毒沙門氏菌為載體 傳遞dna疫苗具有良好的安全性、穩(wěn)定性和免疫原性。構(gòu)建的dna疫 苗既能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗e. tenella的抗體，也能夠顯著增強(qiáng)淋巴細(xì) 胞增值水平，aci為164. 98,對e. tenella的攻擊具有一定抵抗力。 鮑衛(wèi)超等將e. acervulina的q -微管蛋白基因片段插入到真核表達(dá) 載體pcdna31中，構(gòu)建了pcdna3. 1-a-tubulin dna疫苗,試驗(yàn)結(jié) 果表明，50

20、ug的dna疫苗劑量對e. acervulina的攻擊有一定保 護(hù)作用，aci為164,可使雞卵囊排出量降低34. 4%,病變積分下降 33. 3%o ding等用etmic-2基因構(gòu)建的etmic-2-pcdna免疫雞，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)該dna疫苗不僅對e. tenella的感染具有免疫保護(hù)作用，而 且對e. acervulina的感染也有交叉保護(hù)作用。由于兒-2或tfn-y 等細(xì)胞因子在抗球蟲感染中發(fā)揮著重要作用，因此，將細(xì)胞因子與球 蟲保護(hù)性抗原基因聯(lián)合插入到dna疫苗載體中，構(gòu)建成免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗，產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果要明顯優(yōu)于單獨(dú)構(gòu)建的dna疫苗。geriletu等從etenella第二

21、代裂殖子中克隆出mz5-7基因，與雞 il-17基因共同克隆到真核表達(dá)載體pcdna4. oc中，構(gòu)建了 pcdna4. oc-mz 和pcdna4 oc-mz-chil-17 dna 疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)表明， 100 11 g的疫苗劑量對e. tenella的攻擊均具有一定保護(hù)力，卵囊 減少率分別為60. 4%和65. 99%,病變積分下降分別為62. 5%和60%, aci分別為186和190。和對照組相比較，dna疫苗組均誘導(dǎo)雞體脾淋 巴細(xì)胞高水平轉(zhuǎn)錄il-2 和ifn- y mrna,而pcdna4. oc-mz-chil-17 疫苗組和pcdna4. oc-mz疫苗組相比較,差異顯著。x

22、u等將e. tenellata4 基因構(gòu)建了dna 疫苗pcdna3 lb-ta4-chil-2,用100 u g劑量免疫動(dòng)物，結(jié)果顯示，相對增重率為97. 3%,卵囊減少率為75. 1% , aci 為 192 o song 等對 e. tenella dna 疫苗 pcdna3. lb-ta4-chil-2的交叉免疫保護(hù)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，構(gòu)建的疫 苗對e. acervulina 和e necatrix 的aci 分別為 164. 91 和 170.26,但對e. maxima的act為86. 82,說明該疫苗對e. acervulina和 e. necatrix感染有部分交叉免疫保護(hù)

23、作用，對e. maxima感染沒有 交叉免疫保護(hù)作用。song等31從e. acervulina第一代裂殖子 中克隆出乳酸脫氫酶（ldh）基因，構(gòu)建了pvaxldh-chlfn- y和 pvax-ldh-chil-2疫苗,100 ug劑量免疫試驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果顯示，卵 囊減少率分別為56. 82%和57. 59%, act分別為166. 68和168. 78。 song等32還對構(gòu)建的dna疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的變化情況進(jìn)行 了研究，發(fā)現(xiàn)pvax-ldh-chlfn-y 和pvax-ldh-chil-2 均誘導(dǎo)脾臟和盲腸扁桃體中thl型細(xì)胞因了il-2和ifn-y mrna高水平轉(zhuǎn)錄， 與對照組相比差異顯著。muhammad等33從e. acervulina抱子 化卵囊中克隆出csz-2基因，構(gòu)建了 pvaxl-csz-2、 pvaxl-csz-2-chil-2 和pvaxl-csz-2-chifn- y 疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 表明，卵囊減少率分別為63. 3%、80%和62. 4%, act分別為173、 192 和 171 o muhammad 等 34 還將 pvaxl-csz-2 和 p