1、武漢輕工大學畢業論文2013屆畢業論文題目：草魚爛尾病病原細菌Y2的分離鑒定與中西藥物敏感性分析姓 名 蔡廬山 學 號 090702228 院（系） 動物科學與營養工程學院 專 業 水產養殖學 年 級 2009級 指導教師 劉洪明 武漢輕工大學制2013 年 05 月目 錄摘 要11、前言22、材料與方法92.1細菌分離92.2病原菌的生理生化鑒定92.3待測細菌WH125的分子生物學鑒定112.4 細菌的藥物敏感性測定123、結果133.1病魚癥狀133.2病原菌的生理生化鑒定133.3分子生物學鑒定結果163.4菌種判定183.5藥敏試驗結果184、討論19參考文獻22草魚爛尾病病原細菌Y

2、2的分離鑒定摘要本文從實驗室患病草魚身上分離得到一株致病菌，通過對細菌分離培養與純培養、形態與菌落特征、理化特性等表觀分類學指征鑒定的測定；同時擇代表菌株進行了16S rRNA基因的分子鑒定，測定了16S rRNA基因序列、分析了相關細菌相應序列的同源性、構建了系統發生樹；以表型性狀鑒定結果，及細菌發育學分析的結果，進行分離菌的種屬判定。結果表明所檢魚病的致病菌為草魚爛尾病病原細菌Y2。同時還對該病菌進行了藥物敏感性測定，明確了該菌對各種中西藥的敏感性，為治療由草魚爛尾病病原細菌Y2所引起的水產動物疾病提供了理論基礎。關鍵詞：草魚爛尾病病原細菌Y2 16S rRNA 藥物敏感性Isolatio

3、n and identification of pathogenic bacteria Y2 of Grass carp tail rot AbstractIn this paper, a pathogenic bacteria strains were isolated from laboratory sick grass carp. Cultivation of bacteria and pure culture, morphology and colony characteristics, physical and chemical properties such as apparent

4、 taxonomical indications identified measurement. In addition, molecular identification of analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene were applied, the 16S rRNA gene were sequenced and the phylogenetic tree representing genetic relatedness among the isolates and publicly available 16S r

5、RNA gene sequence from GenBank database was constructed; the results showed that the isolates were Aeromonas veronii. The Antimicrobial susceptibilities of selected strains to antimicrobial agents were determined, Results show that the pathogenic bacteria for grass carp fish disease are lousy tail d

6、isease pathogen bacteria Y2, and the sensitive agents were selected in this study, For treatment of grass carp lousy tail disease caused by pathogenic bacteria Y2 aquatic animal diseases provides a theoretical basis Keywords: Grass carp lousy tail disease pathogen bacteria Y2 16S rRNA Antimicrobial

7、susceptibility test (AST)241前言爛尾病是一種常見病，無論是在養魚池、水族箱、網箱、網圍、網欄、水庫中養殖的草魚、斑點叉尾鮰、羅非魚、鰻鱺、暗紋東方鲀、鯉、鯽等多種淡水魚都經常可以發生。只要魚尾部被擦傷，或被寄生蟲等損傷后，魚體抵抗力下降，水質又較污濁，養殖密度高，水中病原菌又較多時，就容易暴發流行，引起魚種大批死亡。隨著魚類的養殖面積不斷擴大，養殖生產中的病害時有發生，根據“2009年中國水產養殖動植物病情監測報告”初步統計，全國魚類因病害造成的直接經濟損失達到52.42億元，因此加強對魚類病害的研究十分必要1。近十多年來，隨著研究技術的發展，該領域的研究工作日益活

8、躍，細菌性疾病常導致養殖和野生魚類的大量死亡，因此對魚類細菌性疾病的研究一直是魚病學主要的研究領域之一2 。徐伯亥等(1986)報道，草魚尾柄病(又稱爛尾病)的病原菌為溫和氣單胞菌。將赤皮病的病原菌熒光假單胞菌、打印病的病原菌嗜水氣單胞菌、細菌性爛鰓病的病原菌柱狀屈橈桿菌分別人工涂抹、浸泡、注射尾部受傷的草魚，均可使草魚患爛尾病。反之，將溫和氣單胞菌人工感染體側受傷的鰱、鳙，則患打印病；人工感染體側受傷的草魚，則患赤皮病。因此，草魚爛尾病的病原菌可能不僅一種，而是有多種。只要尾部受傷后，上述幾種菌都可感染引起患爛尾病；對魚類細菌病一些快速鑒定方法已問世，具體手段如下：1.1常用的細菌鑒定法1.

9、1.1選擇培養基法能抑制多數細菌，僅利于某一種或者某一類細菌生長的培養基稱為選擇培養基。選擇培養基制作簡單，使用方便，已被不少魚病實驗室采用。例如：Rimler-shotts培養基4（R.S瓊脂培養基）用于識別腐皮病的病原嗜水氣單胞菌，伊紅美藍培養基5既是對大腸埃希氏菌的鑒別培養基，同時也可以根據需要作為其生長的選擇培養基。1.1.2經典分類法這是近100年來進行微生物分類的傳統方法，其特點是利用細胞體上隨機和非系統觀察的試驗結果，根據某些主要或顯著的特征性狀進行分類。其常用的特征主要是形態和生理生化特點，并在分類時將特征分為主要和次要特征，一般將結構和形態特點作為初步分類特征，在許多情況下，

10、把它們看成比生理、生化特征更重要的特征。最后應用雙岐法整理實驗結果，排列出分類類群，亦即通常把上述主次相關特征性狀依伯杰氏細菌鑒定手冊6檢索表，便可查出待檢菌株的學名與分類歸屬（中科院微生物研究所細菌分類組，1978）。1.1.3熒光抗體技術熒光抗體技術根據抗原抗體反應具有高特異性的特點，以熒光素作為標記物、與已知的抗體結合作為標準試劑，用于鑒定未知抗原(在熒光顯微鏡下檢查呈現熒光的特異抗原抗體復合物及存在部位)。吳淑勤等應用間接熒光抗體技術(IFAT)對鰻鱺混合感染遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌進行了檢測。用這種方法測定混合感染的準確率較高，達到或超過細菌培養法的水平(尤其是對早期無癥狀的感染

11、)。該技術快速簡便，一組平行集合的組織涂片，分別滴加愛德華氏菌抗血清和幾種嗜水氣單胞菌地區優勢血清型抗血清，按常規步驟操作，2h內可完成取樣至鏡下觀察全過程,確定是混合感染還是單純感染。1.1.4免疫酶技術該技術把抗原抗體的免疫反應與酶的高效催化作用有機結合起來，通過酶的活性降解底物呈現顏色反應，以示抗原抗體特異性反應的存在，免疫酶技術種類較多，目前常用的有ELISA、Dot-ELISA等。錢冬等用酶聯免疫吸附法檢測細菌性敗血癥病原嗜水氣單胞菌，其方法是先制備兔抗AhTPS-30的抗血清，再用抗血清包被，兔抗體特異性地結合待測病原菌，建立了雙夾心ELISA法。該法可檢測出9.77×1

12、0個/ml菌，相當于10ng抗原，與點狀氣單胞菌、溫和氣單胞菌等菌株不發生交叉反應，對白鯽人工感染的病原菌，檢出率達85以上。整個過程僅需1.5 h。沈素芳等應用點酶法(Dot-ELISA)檢測魚類致病性嗜水氣單胞菌重要致病因子ECPase并研制出檢測試劑盒。這種方法敏感性高、重復性好，具有較強的特異性，且可同時檢測大量樣本，并能區分致病性與非致病性。1.1.5單克隆抗體技術單克隆抗體是一個抗體產生細菌與一個骨髓瘤細胞融合而產生得到雜交瘤細胞經無性繁殖的細胞群所產生的，用其檢測病原的優點在于它對抗原位點的特異性及保持細胞系重復獲得相同抗體的能力。1.1.6 PCR(聚合酶鏈反應)技術PCR(P

13、olymerase chain reaction)技術已應用于診斷隱性疾病，檢測臨床標本病原體及法醫遺傳鑒定，最近也被用于水生動物疾病病原的診斷。陸承平等選用氣單胞菌毒素基因中保守區的同源寡核苷酸序列為引物，用PCR技術檢測臨床分離的嗜水氣單胞菌的毒素基因，獲得較為滿意的結果。1.17快速細菌鑒定的方法根據細菌的生化特性，研究生產了多種多樣的細菌鑒定系統，它們使用簡單，能在較短時間內鑒別出病原菌。1.1.8 API-20E系統API20E是目前世界上應用最為廣泛的細菌鑒定系統，主要由含20種脫水基質的微型管組成的API試驗條、試驗結果讀數表和檢測試劑等組成。美國試驗條可對1株細菌進行23個生化

14、實驗。API20E主要用于檢測發酵型革蘭氏陰性桿菌，可對98種腸道革蘭氏陰性桿菌進行準確鑒定。1.1.9 FAME(Fatty Acid Methyl Ester)系統在標準培養條件下培養細菌，然后抽提其脂肪酸，再進行氣相色譜，分析所得數據進行細菌鑒定。FAME分析儀（MIDI，Newark,USA）能將細菌的細胞膜上磷脂轉化為甲酯，然后通過對基本組成分析和圖譜識別軟件將所檢測的細菌鑒定到種或亞種。目前用氣相色譜的脂肪酸分析儀已廣泛應用于鑒定臨床和環境來源的細菌。多年來，短鏈脂肪酸（揮發掾酸，VFAs）分析儀已被用于常規鑒定厭氧細菌。在細菌中已發現越過300種脂肪酸和相關組分。通過檢測細菌有或

15、沒有每種脂肪酸及其脂肪酸含量來確定細菌種類。理論上可以區別2300種不同的組成，但實際是達不到的，因為在細菌體系中，并沒有隨機的分布。此技術優點是，方法簡單、分析快速、材料低耗。而且，全細胞的脂肪酸含量在細胞基因組內是直接和穩定的表達。實際上，細胞內脂肪酸圖譜是表型特征，不受突變、獲得方式或質粒丟失的影響。其主要問題是，細菌的磷脂含量隨種類而變化。盡管分離的微生物脂肪酸圖譜被廣泛地應用于微生物化學分類學，但個別種的脂肪酸圖譜是隨著生長溫度或培養基成分會發生數量變化（更少的情況，性質上也會發生變化），因而對所測試的菌株的培養條件需嚴格標準化。1.2細菌藥敏試驗 體外抗菌藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗

16、（AST），是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的試驗。用藥敏實驗進行藥物敏感度的測定，以便準確有效的利用藥物進行治療。藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。1.3 常用細菌藥敏試驗方法1.31紙片擴散法：WHO推薦的全球統一的標準方法。該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的

17、增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關。1.32定量測定的稀釋法：主要測定細菌對某藥的最低抑菌濃度，包括肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。將不同劑量的抗菌藥物加入融化并冷至50左右的定量MH瓊脂中，制成含有不同遞減濃度藥物的平板。接種待沒測菌（可在一個平板上做多株測定），35孵育1624h，無細菌生長的最低藥物濃度為測試菌的MIC

18、。本試驗特點是可同時做多株菌株的MIC測定，結果的重復性優于肉湯稀釋法，且易于發現污染或耐藥突變菌，是新藥證時常用的外藥敏試驗經典參照標準。1.33抗生素濃度梯度法： 抗生素濃度梯度法（E-test）運用E試條，E試條是一條5mm×5mm的無孔試劑載體，一面固定有預先制備的，嘗試呈連續指數增長稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度即為抗生素抑制細菌的最低濃度。1.3.4 全自動藥敏儀法：常用的藥敏儀器有Vitek Microscan Sensititre ARIS ATB1.4中草藥

19、在魚類疾病防治方面的應用中草藥具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富以及性能多樣化等優點，在防治魚病中，除了兼有藥性和營養性外，還具有提高水產動物生產性能和飼料利用率的功效。因此應用中草藥防治魚病越來越受到人們的關注。長期以來，我國廣大漁民群眾在應用中草藥防治魚病方面積累了豐富的實踐經驗，總結篩選出許多在生產應用中行之有效的單方、驗方。比如：大蒜治腸炎、五倍子治白尾病、鳥桕葉治草魚爛鯉、生姜、辣椒合劑治小瓜蟲病等等。前兩年，我市沿海許多網箱養殖戶采用中草藥合劑治療大黃魚肝腎病。如蕉城區二都一帶養殖戶用板蘭根、車前子、龍膽草、柴胡、茵陳、當歸、甘草為合劑，取各味10，熬汁拌料投喂；三

20、都鎮青山一帶養殖戶用金銀花、板蘭根、茵陳、龍膽草、當歸、甘草為合劑(用量用法同上)，均取得較好的療效。寧德市水技站試驗場以黃芪、黃芩、連翹等為主藥配制的“平肝解毒止血散”被當地養殖戶推崇為治療海水魚肝腎病的首選藥物。實踐證明，中草藥防治魚病，療效好、藥殘量低是一種理想的天然、環保型漁藥。因此，在提倡健康養殖、打擊餐桌污染以及隨著我國加入WTO后，如何應對國際食品質量安全技術壁壘等新形勢下，積極開發、研制、推廣中草藥防治魚病，有著十分重要的現實意義和戰略意義。1.4.1中草藥有效成分的藥效學研究中草藥種類繁多，結構復雜，成分多樣。研究表明，中草藥不但含有大量的生物堿、揮發油、苷類、有機酸、鞣質、

21、多糖、多種免疫活性物質和一些未知的促生長活性物質，而且還含有一定量的蛋白質、氨基酸、糖類、礦物質、維生素、油脂、植物色素等營養物質。這些成分可以促進動物機體的新陳代謝和蛋白質、酶的合成，從而加速水產動物的生長發育，提高免疫力，增強體質，降低發病率和死亡率。幾種常見中草藥化學成份見表11.4.2中草藥在水產健康養殖中的應用中草藥以其天然，環保，無殘留等優點引起人們的廣泛關注，中草藥還具有抗菌，促進免疫功能的有利改善以及提高機體抗病能力等作用，克服了化學藥物和抗生素類藥物的缺陷，此外中草藥還能調節魚體的新陳代謝，提高應激能力，具有抗生素作用，營養作用，雙向調節作用以及誘食作用等功能。因此中草藥作為

22、作為飼料添加劑，并已成為當今水產業研究的熱點9。1.4.3中草藥在魚病防治應用中存在的問題 藥材質量不穩定 由于季節、產地、炮制方法等不同，同一種中草藥，其有效成份含量差異很大，有時同樣的配方卻療效不同。目前還沒有科學的手段對中草藥的質量進行檢測、控制。加工工藝原始 目前中草藥的加工大多以原藥粉碎或切碎煎熬，其配方多為粗制型產品，劑量使用偏大，適口性也差，不利于規模化生產、推廣、應用。同時，中草藥在粉碎時，其藥粉粒度的大小與其有效成份的釋出和動物的吸收有很大關系。應采取先進的生產工藝，對中草藥進行提取、精制，使其向微量化、系列化、專用型方向發展。對漁用中草藥的藥效、藥理研究薄弱 目前中草藥作為

23、漁藥還處于摸索階段，對藥物的有效成份難以確認，治病的藥理尚不十分清楚，使用的劑量沒有嚴格的規范標準。應加強對漁用中草藥藥效、藥理的基礎研究，制定規范的產品標準和劑量標準，使相關的生產、監察部門有章可循。1.5 本文研究目的目前對于爛尾病的病原菌說法尚未統一，治療爛尾病的藥物主要有甲苯咪唑、吡喹酮、阿維菌素、伊維菌素、敵百蟲、辛硫磷等原料藥。由于這些藥物長期使用, 造成了用藥量不斷增大, 耐藥性顯著增強, 致使治療效果明顯下降。其中有些化學藥物不易降解, 有些禁用化學藥物和殘留不但污染環境, 而且殘留在魚體內嚴重危害人類健康。因此, 尋找能夠替代現有化學藥物的無公害、環保型的殺蟲藥物迫在眉睫。鑒

24、于魚類指環蟲病繼發感染病原菌的研究報道尚較少，為豐富該病繼發感染的一些主要生物學性狀及有效檢驗提供一定的參考，本文旨在分離得到的感染細菌，并進行的形態特征、主要理化性狀及系統發育、病原學、藥物敏感性等方面檢驗。為防治該細菌引起的疾病提供理論基礎。現將本文分離到的一株純培養菌Y2進行的形態特征、主要理化性狀及系統發育、病原學、藥物敏感性等方面檢驗結果作如下報告。2材料與方法2.1細菌分離2.1.1 培養基：胰胨豆胨（TSA）配方： 酪蛋白胰酶消化物15g；大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g；氯化鈉 5g；瓊脂 15g；純化水 1000ml；配制方法：取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節pH值使滅菌后為

25、7.3±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60，在無菌操作要求下傾注約20ml，至無菌平皿（90mm3 ）中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養基平皿宜在2-8保存。麥康凱，伊紅美藍，SS選擇培養基均為商品化合成培養基，按標簽提供的方法進行配制，傾注平板，并按上述方法進行保存。2.1.2 細菌來源：取實驗室養殖的患病草魚，進行發病情況調查后取發病瀕死魚及新鮮病死魚做病理變化檢驗。用消毒后的手術剪刀解剖腹腔，用無菌的接種環從其腎臟，肝臟，脾臟，腸道以及鰭基充血處分別取樣，劃線接種于平板培養基上。首先將培養基接種在TSA培養基上，28培養2447h，選取生長良好且于各器官

26、分離平板均有生長的單菌落再進行劃線純化，反復幾次，直到獲得純種后，大量培養，并編號為WH125。2.2病原菌的生理生化鑒定2.2.1形態與菌落特征檢查取WH125純培養菌，分別移接于普通營養瓊脂斜面各2管分置28、37培養18h，無菌狀態下取分離株分別進行革蘭氏染色后，滴生理鹽水于載玻片，取病原菌菌落少許放入水滴中，均勻涂布，使其自然干燥。菌面向上，在酒精燈上方快速的來回幾次，不超過3 s。滴結晶紫染液染色2 min，之后細流水沖洗，用碘液沖去殘水，在白色背景下，滴加95的乙醇脫色。之后用番紅染液染色2rain，細流水沖洗后晾干。鏡檢按照從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的順序觀察。各菌株分別劃線接種于

27、普通營養瓊脂、再將純化了的細菌分別接到麥康凱，伊紅美藍，SS選擇培養基上，觀察細菌的生長情況。置28培養24h和48h，分別檢查生長情況及菌落特征。2.2.2理化特性分析本實驗采用法國梅里埃公司的VITEK 2 System快速鑒定儀進行細菌生理生化指標的檢測。具體方法如下，將純培養的WH125待鑒定菌落， 無菌轉移至清潔試管中。使用接種針或棉棒接種形態相同菌落至無菌生理鹽水，使用VITEK 2 濁度計制備麥氏濁度為0.50-0.63的均一微生物菌懸液（注：懸浮接種物接種于卡前，不能超過30分鐘。）； 將懸浮管及GN卡置于卡槽；GN卡選用革蘭氏陰性細菌鑒定卡（VITEK 2 Gram-Nega

28、tive identification card；VITEK 2 GN Test Kit），GN鑒定卡根據已建立的生化方法及新發展的底物，進行43個生化反應測定碳源利用，酶活性和耐藥性，最終鑒定結果約需要8小時可用。鑒定條主要組成成分詳見附表1.表1.革蘭氏陰性細菌鑒定卡Table.1 VITEK 2 Gram-Negative identification card；VITEK 2 GN Test Kit此方法需材料如下：VITEK 2 GN卡VITEK 2 濁度計VITEK 2濁度計電源適配器VITEK 2濁度計鋰電池VITEK 2比濁儀定標物VITEK 2試管架無菌鹽水（0.45-0.5

29、0NaCl，pH4.5-7.0）12×75mm清潔塑料管無菌針或棉棒合適的瓊脂培基（參閱培養所需表）可選配件：鹽水分配器準備分配鹽水的試管試管帽漩渦震蕩器2.3 待測細菌WH125的分子生物學鑒定2.3.1實驗材料實驗菌：菌株WH125。2.3.2模板DNA的制備細菌于TSA平板25 培養24 h。挑取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 水浴5 min，冷卻后4 10 000 g/min離心10 min，上清液即為PCR擴增反應的模板。2.3.3基因序列的PCR擴增與測序用于16S rRNA基因PCR擴增的正向引物為27F：5-AGAGTTTGATC (C/A)TGG CTCAG-

30、3 (對應于E. coli 16S rRNA基因的第8-27個堿基位置)，反向引物為1492R：5-TACGG (C/T) TACCTTGTTACTT-3 (對應于E. coli16SrRNA基因的第1 492-1 510個堿基位置)。100 µL PCR反應體系中含有：10 µL 10×PCR緩沖液，6 µL 25 mM MgCl2，2 µL 10 mM 4×dNTP，引物各1 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/µL）1 µL，模板DNA2.5 µL。PCR反應條件為：94 預變性4 min

31、；94 變性30 s，55 復性30 s，72 延伸60 s，30個循環；最后72 延伸6 min。PCR產物經瓊脂糖電泳確定特異條帶后，直接交由上海華津生物工程技術公司進行PCR產物的純化和序列測定。2.3.4序列分析與系統發育樹的構建將待測細菌的16S rRNA序列，通過Blast從國際互聯網GenBank數據庫中（）檢索與其同源性較高的細菌基因序列，從中選取2530株與所分析的細菌基因序列同源性較高的已知標準菌株，采用Mega5.0軟件，先選取所有序列運用ClustalX進行多序列匹配排列，用采用鄰位相連法（Neighbor-joi

32、ning method）獲得系統發育樹，通過自舉分析（Bootstrap）進行置信度檢測，自舉數集1000次。2.3.5菌種的歸類判定以經上述表型性狀鑒定結果，主要依據Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（Holt et al., 1994）、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology（Krieg et al., 1984）、Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish（Austin et al., 1987

33、；1999）、常見細菌系統鑒定手冊（東秀珠等，2001）及有關資料，進行分離菌的種屬判定。2.4 細菌的藥物敏感性測定本實驗采用兩種方法對細菌的藥物敏感性進行了測定，中藥成份采用傳統的瓊脂擴散法及KB法進行測定，常用西藥成份的敏感測定則運用法國梅里埃公司的VITEK 2 System革蘭氏陰性細菌藥敏卡片進行測定2.4.1中藥藥敏測定采用定性測定的紙片擴散法(disk diffusion test)，即K-B法，具體如下：步驟:1) 用量筒量取300ml蒸餾水，備用；2) 用打孔器打約200個小圓片備用3) 用電子秤稱取1g中藥藥品于1000ml燒杯中；4) 將量取的蒸餾水加入燒杯；5) 將燒

34、杯放在電熱爐上煮沸至剩余100ml液體，停止加熱，取下燒杯，冷 卻；6) 將冷卻的液體過濾到燒杯中，棄掉殘渣；7) 將過濾后的液體取適量倒入培養皿，加入一定量的小圓片，每個培養皿中的小圓片不能重疊。8) 然后將培養皿放入冰箱，24h后取出圓片，晾干；備用9) 在超凈工作臺中（工作臺使用前滅菌30分鐘），用移液槍取一定量的細菌培養液涂布在培養皿上，間隔一定的區域分別貼上上述小圓片，然后將培養皿放入培養箱。24h后觀察細菌生長情況2.4.2 西藥藥物敏感性測定 作生理生化鑒定實驗時將VITEK 2 System革蘭氏陰性細菌藥敏卡片同時放入機器相應插槽內，將相應該數據讀出，藥敏卡的主要測定項目如表

35、2表2.藥敏卡的主要測定項目Table4. Measurement items of antimicrobial susceptibility test殺菌劑 代碼 濃度g/ml 調用范圍 Camme de C.M.I.阿米卡星AN8,16,64264氨芐西林AM4,8,32232氨芐西林/舒巴坦SAM4/2,16/8,32/162/132/16氨曲南ATM2,8,32164頭孢唑啉CZ4,16,64,464頭孢匹美FEP2,8,16,32164頭孢替坦CTT2,8,32464頭孢他啶CAZ1,2,8,32164頭孢曲松CRO1,2,8,32164環丙沙星CIP0.5,2,40.254厄他培南

36、cETP0.5,1,60.58ESBLESBFEP1,CTX0.5,CAZ0.5,FEP/CA1/10,CTX/CA0.5/4,CAZ/CA0.5/4NEGPOS慶大霉素GM4,16,32116亞氨培南cIPM2,4,16116左旋氧氟沙星LEV0.5,4,80.258呋喃妥因FT16,32,6416512哌拉西林/他唑巴坦TZP4/4,16/4,128/44/4128/4妥布霉素TM8,16,64116復方新諾明SXT0.5/9.5,2/38,16/30420(1/19)320(16/304)圖3.維氏氣單胞菌的革蘭氏染色結果Fig3.Gram stain results of Aeromo

37、nas veronii s3結果3.1病魚癥狀病魚體表局部或大部出血發炎，頭部有碰傷。病魚肝，腎有出血點，腸道偶見發炎充血，有腹水。病魚行動緩慢，反應遲鈍。3.2病原菌的生理生化鑒定對WH125純培養菌，分別按常規做形態特征、菌落特征、理化特性等方面的鑒定，具體鑒定結果如下3.2.1形態與菌落特征圖1 維氏氣單胞菌在血平板上Aeromonas veronii on BA, 48 h, 25.圖2 維氏氣單胞菌在麥康凱瓊脂上Aeromonas veronii on MCA, 48 h, 25.其菌落特征為TSA上圓形光滑、邊緣整齊、灰白色、不透明，培養24 h直徑多在1.6 mm左右(稍隆起)、

38、48 h多在2.0 mm左右(較扁平)，生長豐盛；在血液營養瓊脂上的菌落圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、近乳白色、溶血（見圖1），培養24 h直徑多在1.2 mm左右、48h多在2.0 mm 左右，生長豐盛。細菌在其他培養基上的生長狀況見表3經革蘭氏染色后鏡檢細菌，結果見均存在數量不等、同形態且大小基本一致的革蘭氏染色陰性桿菌，革蘭氏染色陰性、桿狀、散在、兩端鈍圓、有些略彎，無芽孢、大小多在0.30.7 m×1.22.5 m的細菌（見圖3）。表3在不同培養基上的生長表現與菌落特征Tab. 2The growth and colony characteristics of isolates

39、 in different medium培養基 菌 落 特 征麥康凱瓊脂 圓形光滑、邊緣整齊、較扁平、無色，培養24h直徑多在1.2 mm 左右，48 h多在1.8 mm 左右(表面有皺褶)，生長較豐盛（圖2）伊紅美藍瓊脂 圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、同培養基本底色(紫黑色)，培養24h直徑多在0.1 mm左右、48 h多在0.3 mm 左右，生長不良SS瓊脂 圓形光滑、邊緣整齊、較扁平、淺橘紅色，培養24h直徑多在15 mm左右、48h多在20mm左右，生長較豐盛 3.2.2理化特性WH125理化特征表現了一致的結果（如表4）。表4分離菌的理化特性Tab. 3 Physiological a

40、nd biochemical characteristics of isolates特性Characteristic分離菌Isolates特性Characteristic分離菌IsolatesAPPA丙氨酸苯丙氨酸脯氨酸芳胺酶AGLTp谷胺酰芳胺酶ADO側金盞花醇_dGLUD葡萄糖PyrA吡咯烷基芳胺酶_GGT谷胺酰轉移酶+IARLl-阿拉伯醇_OFF葡萄糖發酵dCELD纖維二塘+BGLU葡萄糖苷酶BGAL半乳糖苷酶dMALD麥芽糖+H2S硫化氫dMAND甘露醇+BNAGN乙酰葡萄糖苷酶+dMNED甘露糖+水楊苷SalicinBXYL木糖苷酶BAlap芳胺酸芳胺酶_MNT丙二酸酶ProAL脯氨

41、酸芳胺酶+5KG5酮葡萄糖苷_LIP酯酶+ILATK乳酸鹽產堿PLE古老糖AGLU葡萄糖_TyrA絡氨酸芳胺酶+SUCT琥珀酸鹽產堿+URE尿素酶_NAGAN乙酰半乳糖胺酶dSORD山梨醇_AGAL 半乳糖苷酶SAC 蔗糖+PHOS 磷酸酶dTAGD塔格糖GLYA氨基乙酸芳胺酶_dTRED海藻糖+ODC鳥氨酸脫羧酶_CIT檸檬酸鈉LDC賴氨酸脫羧酶IHISA 組氨酸同化_CMT +BGUR葡萄糖苷酸酶_O129R O/129耐受+GGAA谷氨酸甘氨酸精氨酸芳胺酶_IMLTAL蘋果酸鹽同化_ELLM+ILATAL乳酸鹽同化_注： +示陽性，-示陰性， 是1125%陽性，v，表示有變化，d示267

42、5%陽性，·示文中未記述，F示發酵型， R示抗性；熒光假單胞菌的結果來自Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed和Bergeys Manual of Systematic Bacteriology。3.3分子生物學鑒定結果測序結果表明，所擴增的16S rRNA基因序列長度為1 416bp，具體序列如圖4所示。將菌株WH125的16S rRNA基因序列用Blast在國際互聯網上進行檢索，發現其與氣單胞菌屬的16S rRNA基因序列自然聚類，在相近的100個序列中，86個為氣單胞菌屬細菌的16S rRNA基因序列，

43、菌株WH125與它們的相似性為97%99%。從這100個序列中選取22個進行系統發育學分析，結果如圖5所示，菌株WH125與簡氏氣單胞菌Aeromonas jandaei (NR_037013.2) 和維氏氣單胞菌Aeromonas veronii（NR_044845.1）聚合。且置信度較高。因此，暫將這株的細菌暫定為簡氏氣單胞菌或維氏氣單胞菌。CCTTGCAGTTCGAGCGGCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACC

44、GCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGGATGAACCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTAGCTAATAACTGCCAG

45、CTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGGATAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTAAAACTGTCCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGG

46、AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

47、GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCGTACAGAGGGCTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGCGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAA

48、TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTA圖4. WH125 16S rRNA 序列Fig. 4WH125 16S rRNA sequences圖5. 16S rRNA 基因序列分析聚類圖(數字為自舉次數)Fig.5 Dendrogram of 16 SRNA gene sequences analysis (numbers were bootstrap values)3.4菌種判定 對菌株WH125進一步進行了其它生理生化測試，并且將測試結果查詢主要依據B

49、ergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（Holt et al., 1994）、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology（Krieg et al., 1984）、Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish（Austin et al., 1987；1999）、常見細菌系統鑒定手冊（東秀珠等，2001）及有關資料。根據比較結果，菌株WH125與維氏氣單胞菌生理生化特征基本一致。因此，結合16S rRNA結果，我們將

50、該菌判定為維氏氣單胞菌。3.5藥敏試驗結果用于此次藥敏試驗的中藥共有8種，分別為黃蓮，黃柏，白芍，當歸，刺五加，黨參和白術。實驗結果發現，只有黃蓮和黃柏產生了抑菌圈，抑菌圈的大小分別為20mm和 13mm，說明只有黃蓮和黃柏對該菌均具有一定的殺滅效果，而且黃蓮的效果好于黃柏。用于此次藥敏試驗的西藥種類主要有阿米卡星，環丙沙星等，具體種類和濃度如表所示。其中敏感種類15種，耐藥種類兩種分別為氨芐西林和氨芐西林|舒巴坦。而環丙沙星和左旋氧氟沙星的MIC均小于0.25g/ml，并且均為常用漁藥，因此可以用作治療此菌引起疾病的主要藥物。藥敏試驗結果見表5表5 藥敏試驗結果Table5. Results

51、 of the antimicrobial susceptibility test抗菌藥物MIC敏感度氨芐西林32耐藥氨芐西林/舒巴坦32耐藥頭孢唑林/他唑巴坦4敏感頭孢唑林4敏感頭孢替坦4敏感頭孢他啶1敏感頭孢曲松1敏感頭孢吡烏1敏感氨曲南1敏感亞胺培南1敏感阿米卡星2敏感慶大霉素1敏感妥布霉素1敏感環丙沙星 0.25敏感左旋氧氟沙星 0.25敏感呋喃妥因16敏感復方新諾明20敏感由鑒定結果我們可以知道，維氏氣單胞菌對氨芐西林，氨芐西林/舒巴坦不敏感，對頭孢唑林，頭孢替坦，頭孢他啶，頭孢曲松，頭孢吡烏，氨曲南，亞胺培南，阿米卡星，慶大霉素，妥布霉素，環丙沙星，左旋氧氟沙星，呋喃妥因，復方新諾

52、明敏感。4討論1983年，美國疾病控制與預防中心(Center for Disease control and prevention，CDC)陸續收到1l株鳥氨酸脫羧酶陽性的細菌，被編為“腸道群77(Enteric group 77)”，經鑒定其中9株氣單胞菌屬的新種(spnov.)， 并為紀念法國微生物學家Veronii在弧菌和氣單胞菌研究中的貢獻將其命名為維氏氣單胞菌。在水產養殖動物方面，2000年，李本旺等曾報道從出現口咽腔潰爛的中華鱉脾臟分離到布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)和維氏氣單胞菌，經對健康鱉做人工感染試驗表明維氏氣單胞菌能引起供試鱉100% 發病與死亡

53、。本次所檢中華絨螯蟹病例，盡管為鰻利斯頓氏菌、弗氏檸檬桿菌和維氏氣單胞菌的混合感染，但維氏氣單胞菌經人工感染試驗顯示出較強的致病作用，且可單獨引起感染蟹的發病與死亡，進一步提示了該菌在水產養殖動物中的病原學意義。本文用TSA等5種不同培養基做劃線接種后28培養觀察，發現該菌在供試的、血液(家兔血或綿羊血)營養瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂等4種培養基上生長均較好，在伊紅美藍瓊脂培養基上生長較差。因此認為對該菌分離鑒定時，可根據情況予以選擇使用。本實驗采用法國梅里埃公司的VITEK 2 System快速鑒定儀進行細菌生理生化指標的檢測。但由于該系統中水產細菌的各類并不全面，所以我們只采用其生理生化指

54、標，不接受其結果，最后結果的判定則是通過上述測出的生理生化指標查詢Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed等參考文獻，并結合分子生物學鑒定結果來確定分享菌株的種屬。經以37種抗菌類藥物對3株維氏氣單胞菌的藥敏測定 ，表明在不同菌株間對某種抗菌類藥物敏感或耐藥無明顯差異性。但考慮到細菌對抗菌類藥物耐性變異的頻繁特征，也加之本次所檢菌株在區域分布、菌株數量等方面的局限性，認為明確該菌的耐藥規律等還需對不同區域、不同來源等大量分離株的檢驗。同時，在指導用藥時最好是對相應病例分離株做藥敏測定后選擇高敏藥物使用，以保證最佳防治效果

55、。中草藥以其天然，環保，無殘留等優點引起人們的廣泛關注，中草藥還具有抗菌，促進免疫功能的有利改善以及提高機體抗病能力等作用，克服了化學藥物和抗生素類藥物的缺陷，此外中草藥還能調節魚體的新陳代謝，提高應激能力，具有抗生素作用，營養作用，雙向調節作用以及誘食作用等功能。關于中草藥防治細菌性疾病的應用和報道最多。常用的藥物有穿心蓮，大黃，黃芪，黃連，黃柏，五倍子，地錦草，大蒜，生姜，魚腥草，金銀花，艾葉，大青葉，金櫻子，紫花地丁等。用于此次藥敏試驗的中藥共有8種，分別為黃蓮，黃柏，白芍，當歸，刺五加，黨參和白術。實驗結果發現，只有黃蓮和黃柏產生了抑菌圈，抑菌圈的大小分別為20mm和 13mm，說明只有黃蓮和黃柏對該菌均具有一定的殺滅效果，而且黃蓮的效果好于黃柏。因此可以用黃蓮對該菌引起的疾病進行治療。維氏氣單胞菌廣泛分布于水體環境中，夏、秋兩季繁殖較快，特別是水質惡化、水產動物機體創傷或免疫力降低時，能引起很高的死亡率，多為溫和生物型的感染，患病動物以出血和腹水為主