1、題 目: 學(xué) 號: 姓 名: 年 級: 學(xué) 院: 系 別: 專 業(yè): 指導(dǎo)教師: 完成fi期:海南石斛蘭黑點(diǎn)病的病原鑒定海南大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計）b07120422007 級環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全系農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全副教授2011年05月10日摘要木文研究的三亞地區(qū)石斛蘭黑點(diǎn)病是一種真菌性病害。病斑多發(fā)生于 葉端及葉緣，發(fā)病初期在葉片上產(chǎn)生針尖大黑色小點(diǎn)。后期病斑逐漸擴(kuò)展 成圓形大斑。病斑屮間深褐色，邊緣黑色或暗黑色。發(fā)生在葉緣的病斑常 互相融合成不規(guī)則條形斑。嚴(yán)重時，葉片會局部壞死或整葉枯死。本試驗 對石斛蘭黑點(diǎn)病的病原菌進(jìn)行分離純化，再根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行接種實驗 發(fā)現(xiàn)該分離物能引致

2、與do間石斛蘭病害和似的癥狀。提取病原菌菌絲dna 后應(yīng)用rdna-lts序列分析鑒定，并隨之進(jìn)行同源性分析后發(fā)現(xiàn)菌株與 phyllosticta sp.的同源性為100%,表明石斛蘭黑點(diǎn)病的病原菌為葉點(diǎn)寄 屬phyllosticta ）。i大i此，本研究為該病害的科學(xué)防治提供了一定的指 導(dǎo)意義。關(guān)鍵詞：石斛蘭；黑點(diǎn)病；病原鑒定；葉點(diǎn)霉屬abstractblack spot disease is one of the important plant disease of the dendrobium in sanya,hainan. the disease is belonging to a

3、fungal disease and occurs at the edge of leaf mainly. at first,the size of disease spot is very small and its color is black. later,the disease spot expands into a large,round spot gradually. the color of central disease spot is dark brown,while the edge's color is black or dark black. disease s

4、pot occuring at the edge of leaf formed into irregular stripe. when it was serious,some leaves died partly or integrally. during experiment,we got the pathogen coming from infected leaves through the process of separation and purification. and then,we cultivated pathogen on the pda. according to the

5、 koch's rule,we inoculated the separated pathogen to the tender leaves. after a period of time,we found that pathogen can cause the same kind of symptom on the leaves compared with the previous observeation in the field- through the pathogen dna cxtractionjdna-its sequence analysis and allogenic

6、 analysis,we found that the bacterial strain is similar to phyllosticta sp. completely. the above result demonstrated that the pathogen of black spot disease is phyllosticta . at the same time ,it provided certain theoretical basis for the disease control.keywords: dendrobium ； black spot disease； p

7、athogen identification； phyllosticta目錄1前言42材料與方法52.1試驗材料52.1.1試驗樣品52.1.2幽與試劑52.1.3培養(yǎng)基的配制52.1.4相關(guān)試劑的配制52.2主要儀器.62.3試驗方法62.3.1病原菌的分離與純化62.3.2病原菌的致病性測定7233病原菌的繁殖培養(yǎng)72.3.4病原菌dna的提取72.3.5 dna提取產(chǎn)物的檢測72.3.6 dna提取產(chǎn)物的pcr82.3.7 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及冋收82.3.8 pcr回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化92.3.9菌液pcr及陽性轉(zhuǎn)化子測序103結(jié)果與分析103.1 d間病害癥狀103.2病害分離菌的

8、培養(yǎng)性狀103.3分離物的致病性測定103.4病原菌rdna -its序列分析123.5提質(zhì)粒電泳檢測連接載體結(jié)果123.6 dna序列測定及同源性分析結(jié)果134結(jié)論與討論13致謝15參考文獻(xiàn)161刖呂蘭花(cymbidium spp.)在植物學(xué)上屬于單了葉蘭科，為多年生草木植 物，附生、地生或腐生。蘭花是有花植物屮最大的科之一，估計有800屬, 35萬個原生科»我國已知的蘭屈植物有31利a占全球分展的一半以上。 分布地區(qū)很廣，全國除華北、東北以外，都有分布。蘭花不僅具有極高 的觀賞價值，還具有獨(dú)特的食用和藥用價值。蘭花的根、葉、花、果、種 了均有很高的藥用價值。據(jù)資料報道，蘭花對于

9、現(xiàn)代人類高發(fā)病癥一癌癥 也有較好的功效。海南地處熱帶亞熱帶，溫暖潮濕，十分適合卡特蘭、蝴蝶蘭、石斛蘭、 文心蘭等熱帶蘭花生長。近年來海南蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速，種植面積從 20世紀(jì)90年代末的幾千平方米發(fā)展到現(xiàn)在的25萬m2以上然而，隨著 海南蘭屁產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，各種問題和繼出現(xiàn)，制約蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展。尤其是 一些真菌、細(xì)菌性病害，以其病原多、傳播快、潛伏期長等特征給蘭花的 工產(chǎn)化生產(chǎn)帶來不利影響，造成蘭花觀賞性降低，經(jīng)濟(jì)效益受損。蘭花 主要的病害是由真菌引起的，至少占整個病害的2/3以上,主要有炭疽病、 黑點(diǎn)斑病、枯萎病、褐斑病、葉斑病和白絹病等。在三亞蘭花種植基地 進(jìn)行病害調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)很多石斛蘭葉

10、片上發(fā)生了一種較為嚴(yán)重普遍的黑點(diǎn) 病害。病斑多發(fā)生于葉端及葉緣，病斑屮間深褐色，邊緣黑色或暗黑色。 嚴(yán)重時，葉片會局部壞死或整葉枯死。為了控制該病害在蘭花上的繼續(xù)發(fā) 生與為害，我們對引起海南石斛蘭黑點(diǎn)病的病原物及其特性進(jìn)行了研究。位于28s rdna的3端與18s rdna的5端之間的序列稱為核糖體內(nèi) 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers, its)。真菌的 rdna -its 序列是屮度重復(fù)序列，廣泛分布于基因組。基于rdna-lts的多態(tài)性的序列 分析，由于可以從不太長的核酸序列小獲得相對足夠的信息用來反映生物 親緣關(guān)系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定的依

11、據(jù)之一，目前己廣泛應(yīng) 用于真菌的屬種間及部分種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學(xué)研究。本研究采用了一 對真菌its擴(kuò)增通用引物，通過對導(dǎo)致石斛蘭黑點(diǎn)病的病原菌dna進(jìn)行提 取擴(kuò)增及序列測定再結(jié)合blast比對，確定了病原菌的類別，為此種病害 的科學(xué)防治提供了理論依據(jù)。2材料與方法2. 1供試材料2. 1. 1試驗樣品右斛蘭病葉，采自于海南三亞柏盈蘭花有限公司蘭花種植基地。 2.1.2酶與試劑taq dna 聚合酶、t4 連接酶、loxtaq buffer、dntp mixture. pgmt 載體、dna marker ik 引物 its1： (5' -tccgatggtgaacctgcgg-3

12、9;)、 引物 its4: (5 -tcctccgcttattgatatgc-3?)、大腸桿菌 top1o 感受 態(tài)細(xì)胞、普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒。2. 1. 3培養(yǎng)基的配制按照方屮達(dá)切的方法配制pda培養(yǎng)基、pdb培養(yǎng)基及l(fā)b液休培養(yǎng)基。pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g,葡萄糖15g,瓊脂20g,將洗凈后去皮的馬鈴 薯切碎，加水煮沸0. 5h,然后用紗布過濾去掉馬鈴薯渣收集濾液，加水補(bǔ) 至1000ml,再將稱量好的葡萄糖和瓊脂加入，加熱使瓊脂完全融化后，分 裝滅菌(121°c, 20min)<>pdb培養(yǎng)基：馬鈴薯200g,葡萄糖15g,將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎， 加

13、水煮沸0. 5h,然后用紗布過濾去掉馬鈴薯渣收集濾液，加水補(bǔ)至loooml, 再將稱量好的葡萄糖加入，加熱使葡萄糖完全融化后，分裝滅菌(121°c, 20min)olb液體培養(yǎng)基：胰化蛋白月東10g,酵母提取物5g, nacllog,搖動容器 直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/l naoh調(diào)ph至7. 0,并用去離子水定容至1l, 分裝后高壓滅菌(121°c, 20min)o2.1.4相關(guān)試劑的配制0. 5m edta：在 70mlddh20 溶解 1& 61gna2edta. 2h20,用 10m naoh (約 5ml)調(diào) ph 至 8.0,補(bǔ)水至 100 ml0i

14、m tris. cl：在80mlddh20中溶解12. lg tris堿，用濃鹽酸調(diào)ph至 8. 0,補(bǔ)水至 loomlo5mnacl：取29. 2g nacl加ddllo至100ml,放在全自動高溫滅菌鍋中,調(diào)節(jié)溫度為121°c,滅菌20mino5m kac： 29. 5ml 冰乙酸用 koh 顆粒調(diào) ph 至 4. 8, # ddh20 至 looml, 室溫保存（不可高溫滅菌）。3m naac： 50mlddh20 溶解 40. 81g naac. 3h20,用冰醋酸調(diào) ph 至 5. 2, 加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌，儲存于4°c冰箱中。10%sds：稱取

15、logsds溶于ddh20至looml,高壓滅菌。20%pvp：稱取20gpvp溶于ddh/）至looml,高壓滅菌。氯仿/異戊醇（24/1）：量取氯仿、異戊醇體積比為24:1odntps的準(zhǔn)備：將每種loomm的dntps各取10ul溶于360ul的ddh2o 中，即為2. 5mm的dntps。rnase 母液的配制：25mgrnase 酶溶于 loomm tris. hcl （ph 約為 7. 5）, 加15mm nacl配成lomg/ml, 100°c加熱15min,冷卻后分裝于-20°c保存。loomg/ml amp:將lg amp溶于8ml水中定容至loml, 0

16、. 22m濾器超濾 除菌分裝后貯t-20° c冰箱中備用。20mg/ml x-gal:將x-配1 （5-漠-4-氯-3-呵味一d半乳糖昔）溶于二 甲基甲酰胺屮配成20mg/ml的溶液貯于eppendorf管屮并包好錫箔貯于一 20°c冰箱屮備用。loomg/mliptg:將238mgiptg（異丙基|3d硫代毗喃半乳糖昔）溶于 10譏水中后用0. 22um濾器超濾除菌，分裝成1譏小份貯丁一20°c冰箱中備 用。2. 2主要儀器恒溫振蕩器、pcr儀、恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、全自動高溫滅菌鍋、 瓊脂糖凝膠電泳儀、紫外成像儀、臺式離心機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、光學(xué)顯 微鏡、移

17、液槍、三角瓶、大小燒杯、玻棒、接種針。2. 3試驗方法2. 3.1病原菌的分離與純化挑取蘭花病癥比較明顯的病葉，剪取病健交界處約5 mm見方的小塊病 組織，經(jīng)過70%乙醇和01%升汞消毒、滅菌水漂洗3次后，將小塊病組織 轉(zhuǎn)移至含pda培養(yǎng)基中。放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天后，挑取菌落邊緣的 菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?. 3. 2病原菌的致病性測定按照方中達(dá)9】的方法，在a株石斛蘭葉片上的一片幼葉用接種針刺3 組傷口，每組3個，作為接種處理組；在b幼株葉片同樣刺3組傷口，每 組3個，作為對照組ck；從培養(yǎng)兩天后的菌落邊緣挑取適量菌絲接種到a 株幼葉的傷口處，帶菌絲面向下，使其與傷口緊密接觸，在該

18、葉片傷口處 接種3個重復(fù)。在b株幼葉上以噴無菌水作對照。保濕培養(yǎng)一段時間后， 觀察葉片上的癥狀。2. 3. 3病原菌的繁殖培養(yǎng)在潔凈工作臺上，用接種針挑取菌落邊緣的少量菌絲置于裝有pda培 養(yǎng)基的三角瓶屮，再將三角瓶放在恒溫振蕩器屮，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度37°c,轉(zhuǎn) 速160r/min,振蕩培養(yǎng)三天，繁殖出大量菌絲為dna提取備用。2. 3. 4病原菌dna的提取參考謝人杰i等人介紹的方法進(jìn)行dna提取，具體操作步驟如下。稱菌絲組織lg,液氮研碎,加1.5ml（65°c預(yù)熱的）細(xì)胞裂解液（即dna 提取液），再加150吐飽和酚、1.5nil氯仿，輕搖，65°c保溫30mi

19、no取出后加 2ml5m kac（存 4°c）, -20 °c 放 30min, loooorpm 離心 lomin, 取上清，移至另一支7ml離心管。加0.6倍體枳冷異丙醇，0.1體枳3m naac,放于- 20°c冰箱2h。 loooorpm離心loinin棄上清，保留沉淀，70%冷乙醇洗滌兩次，放潔凈工作 臺上吹干。力加lte（存4°c）, 10吐rnase搖勻放65°c水浴20min ,用等體積tris平衡酚抽提，氯仿/異戍醇抽提，室溫放5min, loooorpm離心10min。取上清，等體積異丙醇、1/10v 3m naac, -2

20、0°c沉淀lh, loooorpm離 心10min,棄上清，70%冷乙醇洗滌，潔凈工作臺吹干后溶于100吐te, -20°c保存。2. 3.5 dna提取產(chǎn)物的檢驗取dna提取液4吐,澳酚藍(lán)上樣液4吐，將兩者充分混合后放置于瓊脂 糖凝膠電泳儀泳道內(nèi)，電泳55min,將卡槽拿到紫外成像儀進(jìn)行拍照，根據(jù) dna帶的亮度大小進(jìn)行稀釋，為pcr擴(kuò)增進(jìn)行準(zhǔn)備。2. 3.6 dna提取產(chǎn)物的pcr依據(jù)dna帶的亮度人小將dna提取液稀釋20倍，取其稀釋液進(jìn)行pcr 擴(kuò)增。pcr 反應(yīng)體系為：loxtaq buffer 2. 5gl> dntp mixture 2吐、taq dna

21、 聚合酶0.4此、pcr擴(kuò)增引物（its1、its4）各05此、dna模板2此，補(bǔ) ddh20 至 25ptlopcr反應(yīng)步驟為：94°c預(yù)變性5 min； 94°c變性30 sec, 51°c退火30sec, 72°c延伸45sec,循環(huán)33次；最后72°c延伸10 min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測2. 3. 7 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及回收2. 3. 7. 1 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測取pcr擴(kuò)增液25此、澳酚藍(lán)上樣液5吐，充分混合后用移液槍注入瓊 脂糖凝膠電泳儀泳道內(nèi)，在相鄰的泳道內(nèi)注入7m的marker ii,電泳50min,

22、 用紫外成像儀進(jìn)行拍照顯現(xiàn)dna帶。根據(jù)帶的亮度情況，在紫外線照射下 選擇性地切下帶有瓊脂的dna條帶。2. 3. 7. 2 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的回收柱平衡：向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管）加入500平衡液bl, loooorpm離心lmin,倒掉收集管中的廢液，將收集管中重新放回收集管中。將單一的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干 凈的離心管屮。向膠塊屮加入3倍體積溶膠液pn （約為600吐），50°c水浴放置10min, 其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的 膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，宜至膠塊完全溶解。將上一步所得溶

23、液加入一個吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中），室 溫放置2min, loooorpm離心lmin,倒掉收集管屮的廢液，將吸附柱ca2 放入收集管屮。向吸附柱ca2中加入600al漂洗液pw, loooorpm離心lmin,倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱中ca2加入600pl漂洗液pw, loooorpm離心lmin,倒掉廢液。將吸附柱ca2放回收集管loooorpm離心加in,盡量除盡漂洗液。 將吸附柱ca2置于潔凈工作臺，室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留 的漂洗液影響下一步的操作。將吸附柱ca2放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 適量緩沖液eb

24、,室溫放置2mino loooorpm離心2min收集dna溶液（為了 提高dna的回收量，可將離心得到的溶液重新加回到離心吸附柱屮，重復(fù) 步驟8）。2. 3. 8 pcr產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化2. 3. 8. 1 pcr產(chǎn)物的連接利用回收試劑盒回收目的dna條帶，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與pgm-t載體連 接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有iptg和x-gal的lb平 板上篩選門色菌落。將pgm-t載體在冰上融化，短暫離心，以免液體掛在管辟上。按照一定的比例進(jìn)行添加連接，載體與目的pcr片段的摩爾比控制適 當(dāng)。連接體系:目的pcr片段4al、pgm-t載體1al、10xdna ligati

25、on bufferdna ligase （3um） 1pl、加 ddh20 至 10從。輕輕彈動離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心，16°c水浴鍋中連接過夜。 2. 3. 8. 2 pcr產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化平板的制備：向鋪好的含有和應(yīng)抗生素（loomg/ml）的固體瓊脂 平板 lb 表面加入 4pl 的 ipig （200mg/ml）, 40pl 的 x-gal （20mg/ml）,使 用無菌的彎頭玻棒將其均勻涂開，避光置于潔凈工作臺上，37°c放置lh, 使溶解x-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。取5從連接產(chǎn)物加到50m人腸桿菌top 10感受態(tài)細(xì)胞中（感受態(tài)細(xì)胞 從-70

26、76;c冰箱中取出，放于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物 的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10）,輕彈混勻，冰浴30mino將離心管置于42°c水浴90s,取出后立即置于冰浴屮23min,期間不 要振動離心管。向離心管中加入預(yù)熱的（約37°c）、不含抗生素的lb培養(yǎng)基,180rpm,37°c搖蕩培養(yǎng)45min,使質(zhì)粒上和關(guān)的標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。將離心管內(nèi)容物混勻，吸取50ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含有相應(yīng)抗 生素的lb固體培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 室溫育至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37°c培養(yǎng)1216h。pcr轉(zhuǎn)化

27、產(chǎn)物的檢測:將靠近藍(lán)斑周圍的單個白斑菌落用滅菌牙簽接種 到5mllb液體培養(yǎng)基屮，37°c搖床搖蕩培養(yǎng)1214h,保存菌種后提取質(zhì)粒, 應(yīng)用pcr擴(kuò)增方法鑒定插入片段是否正確。2. 3.9液pcr擴(kuò)增及陽性轉(zhuǎn)化子測序取上述步驟8中菌液渾濁的液體進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因是否與載體連接。將陽性轉(zhuǎn)化了送廣州華大基 因科技股份有限公司測序。pcr 反應(yīng)體系:菌液 0. 3 gl,引物 itsl(10um)0. 5吐，引物 its4(10um)0. 5吐，10xtap buffer 2. 5pl, dntp mixture 2al, taq dna 聚合酶

28、(2. 5u/al)0.4al,加入ddh20定容至25m。pcr反應(yīng)步驟為：94°c預(yù)變性5 min； 94°c變性30 sec, 51°c退火30sec,72°c延伸45sec,循環(huán)33次；最后72°c延伸10 min。3結(jié)果與分析3.1田間病害癥狀石斛蘭黑點(diǎn)病主要危害葉片，多發(fā)生于葉端及葉緣。初期在葉片產(chǎn)生 針尖大黑色小點(diǎn)。后期病斑迅速擴(kuò)人為圓形人斑。病斑中間深褐色，邊緣 黑色或暗黑色。發(fā)生在葉緣的病斑常和互融合成不規(guī)則條形班。嚴(yán)重時， 葉片會局部壞死或整葉枯死（如圖1-a）o3. 2病害分離菌的培養(yǎng)性狀在pda上，病原菌的分離物經(jīng)過一段

29、時間的純化培養(yǎng)形成菌落。菌落 呈圓形，生長快速，大而致密。表面顏色為灰褐色，不透明，正反兩面顏 色較接近。菌落比較干燥，邊緣整齊。挑取該培養(yǎng)基上的菌絲制片觀察， 其形狀為絲絮狀，中間有橫隔（如圖1-b）o3. 3分離物的致病性測定回接病原物至健康石斛蘭植株的幼葉上,通過傷口接利u如圖2-a）,發(fā)現(xiàn)在溫度20°c25°c、濕度大于90%時，經(jīng)過15d左右病原菌可侵入葉片內(nèi)引 起與出間石斛蘭病害相同的癥狀（如圖2-b） o而對照組采用噴灑無菌水處 理，在相同吋間過后，葉片針刺部位無明顯變化，只是針刺部位稍微凹陷。 從患病部位重新分離病原菌，純化培養(yǎng)后得到和同形態(tài)的菌落，表明從石

30、 斛蘭患病部位分離到的病原菌為出間石斛蘭病害的致病菌。圖1病葉癥狀及病原菌菌落形態(tài)a石斛蘭病害r1間癥狀b分離物的菌落形態(tài)圖2病原菌冋接及發(fā)病癥狀a健康葉片針刺傷口后，挑取菌絲塊接種b成功接種發(fā)病的蘭花葉片3. 4病原菌rdna -its序列分析從瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明（如圖3）,用引物its1和its4擴(kuò)增得 到的蘭花黑點(diǎn)病菌株的rdna-lts區(qū)域序列，菌株的pcr產(chǎn)物條帶在一條直線匕線條清晰明亮，長度約為600 bpom 12bp1200700.504300-100-34600bp1-4：病原菌dna提取液its擴(kuò)增結(jié)果m： dna marker ii圖3 pcr產(chǎn)物的檢測電泳圖譜3

31、.5提質(zhì)粒電泳檢測連接載體結(jié)果從瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表示（如圖4）,采用的引物能擴(kuò)增得到預(yù)期大小的產(chǎn)物，電泳呈單一明亮條帶，表明目的基因片段與pgm-t載體成功連接。bp1200-700500300一1001-4：挑収口斑鬧洛培喬旳菌液 m： dna marker 11 圖4提質(zhì)粒進(jìn)行pcr檢測目的片段連接至載體的電泳圖譜m 12343.6 dna序列測定及同源性分析結(jié)果tactcactatgttgctttggcgggtcgacctggttccgacccaggcggccggcgcccccagccttaactggcc aggacgcccggctaagtgcccgccagtatacaaaactc

32、aagaattcattttgtgaagtcctgatatatcattt aattgattaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagt aatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggc atgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagctctgcttggtattgggcaacgtccgctgccggacgtgcct tgaagacctcggcgacggcgtcctagcctcgagcgtagtagt

33、aaaatatctcgctttggagtgctgggcgacg gccgccggacaatcgaccttcggtctatttttccaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaact taagcatatcaataagcggaggaaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagct cccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatag ctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaaca

34、tacgagccg通過對病原菌rdna-its序列在genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)彳亍megablast同源性 分析，結(jié)果表明菌株與phyllosticta sp.的同源性為100%,根據(jù)該比對結(jié) 果以及病原菌回接在石斛蘭葉片上的致病癥狀，將石斛蘭黑點(diǎn)病的病原物 鑒定為葉點(diǎn)霉屬，為半知菌類真菌。4結(jié)論與討論葉點(diǎn)霉屬phyllosticta )是person于1818年創(chuàng)立的展名。因在國 際半知菌類命名法規(guī)有效期(1828)之前，故將其屬名作為無效屬名處 理。1847年desmazieres重新描述了該屬為有效屬名phyllosticta per. ex desm. o其模式種為鈴蘭葉點(diǎn)霉(q con

35、vallariae pers.),目前全世界已 報道phyllosticta 2000余種說葉點(diǎn)霉屬形態(tài)與莖點(diǎn)霉屬相似，寄生 性較強(qiáng)，主要危害葉片引起葉斑病。通過上述實驗中對石斛蘭病害病原物的菌落形態(tài)觀察，病原菌的致病 性測定以及通過提取病原菌dna后的rdna-its序列測序和同源性分析，初 步確定引起海南石斛蘭葉片黑點(diǎn)病的病原為半知菌類腔抱綱球殼抱目葉點(diǎn) 霉屬(phyllosticta sp.)。據(jù)資料報道，引起海南熱帶蘭花發(fā)生黑點(diǎn)病 的病原物為半知菌類亞門真菌，多為葉點(diǎn)霉屈，有的為大莖點(diǎn)霉、殼針砲 霉和殼二泡霉。但目前，國內(nèi)尚未出現(xiàn)對石斛蘭黑點(diǎn)病的病原物進(jìn)行鑒定 的資料。因此，本研究為病

36、害的科學(xué)防治提供了一定的理論依據(jù)。在實驗過程小，病原菌分離物在一定時間內(nèi)未能產(chǎn)生分生孑包子，導(dǎo)致 不能依據(jù)分生抱子器形態(tài)、分生砲子形狀大小這些特征從傳統(tǒng)的真菌形態(tài) 觀測角度去鑒定病原物，因而對病害病原的準(zhǔn)確鑒定產(chǎn)生了不利影響。此 外，由于皿間病害的發(fā)生需要具備高溫高濕的環(huán)境條件，而進(jìn)行實驗時氣 溫相對較低且不穩(wěn)定，因而在做病害分離物的致病性測定時，分離物在葉 片上從接種到發(fā)病經(jīng)歷的時間較長，可能是與上述環(huán)境因素存在一定的聯(lián) 系。在進(jìn)行blast比對分析吋，核酸序列數(shù)據(jù)庫中較多的相似序列會給比對 分析工作帶來兩方面的影響：一是能提供更大的參考意義和更豐富信息用 于系統(tǒng)學(xué)研究，另一方面過多的相似序

37、列也會給鑒定工作帶來一定的困難 2，而且隨著genbank的不斷豐富，相似序列述會更多，此時：最好再 使用其它序列比對分析工具也許會有益于鑒定工作，如使用dnaman所繪制 的系統(tǒng)樹(phylogenetic tree)可能會發(fā)現(xiàn)與待檢序列的同源性距離最近的 序列。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生化等表型方法進(jìn)行鑒定，不能過分依賴its序列 分析而把它作為傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)方法的替代方法。口前rdna-its序列分析并不是能對所有真菌的屬種或組群進(jìn)行鑒別， 究其原因：其一，its區(qū)序列盡管是可變的，但對于某些物種其可變的程度 相對不高，并不足以用來分析其屬種或組群間的差異2叫 其二，its序 列分析結(jié)果還受到比對使用的基因庫完善程度的影響。因此,在基因庫中存 在的、與待檢真菌親緣關(guān)系相近的已知真菌序列缺乏時或rdna-its序列上 表現(xiàn)為極小的差異性時，its序列分析的應(yīng)用能力就受到一定的限制,此時, 建議將its序列分析結(jié)果與傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(真菌培養(yǎng)特征、鏡 檢特征等)相結(jié)合才能正確地對真菌進(jìn)行鑒定，以防止誤檢、錯檢。盡管目 前rdna-its序列分析的應(yīng)用存在一定的限制，但隨著新技術(shù)新方法在its 序列分析上的運(yùn)用以及生物信息學(xué)的不斷完善，相信rdna-its序列分析的 應(yīng)用將會有更大的發(fā)展空間。致謝木文是在史學(xué)群老師的悉心指導(dǎo)下完成的。史老師從選題、撰寫