1、紙層析的實驗報告 前言 紙層析法 紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應用的一種別離技術。本世紀初俄國植物學家m.tswett發現并使用這一技術證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。現在層析法已成為生物化學、分子生物學及其它學科領域有效的別離分析工具之一。它是一種以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動相為不與水相溶的有機溶劑；也可使紙吸留其他物質作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進行展開。當組分移動一定距離后，各組分移動距離不同，最后形成互相別離的斑點。將紙取出，待溶劑揮發后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點位置。根據組分移動距

2、離（rf值）與樣比擬，進行定性。用斑點掃描儀或將組分點取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。 紙層析法（paper chromatography）是生物化學上別離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于蛋白質的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質的一種別離分析工具。紙層析法是用濾 紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動相。 在環境分析測試中，有時用紙層析法別離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如gc、hplc應用普遍。在 做葉綠體色素別離時用

3、到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對含量和種類。 紙層析法一般用于葉綠體中色素的別離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴散地快，反之那么慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素別離。 氨基酸 氨基酸是構成蛋白質的根本單位，廣泛用于食品、醫藥、添加劑及化裝品行業。隨著生物工程技術產業的開展逐漸成為2l世紀全球的主要產業之一，氨基酸的需

4、求量越來越大，品種變更越來越快，工藝改革越來越新。目前全世界氨基酸每年的產量為100萬噸，而需求總量是800萬噸。我國自20世紀60年代起，氨基酸的應用在食品工業占61，在飲料工業占30，醫藥、日用化工、農業、冶金、環保、輕工、生物工程技術等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人類生活的很多方面都有著應用： (1)在食品行業的應用 (2)在醫藥工業的應用 (3)在飼料添加劑行業的應用 (4)在化裝品行業的應用 (5)在農業上的應用 (6)在其他行業的應用 氨基酸工業還有著廣闊的開展前景： (1)傳統的氨基酸生產方法 (2)運用基因工程手段生產氨基酸 (3)大力開展藥用中間體,具體為： 氨基酸及其

5、衍生物逐漸成為藥用中間體 非天然氨基酸是合成活性藥物的重要原料 生產高附加值的非天然氨基酸 一、實驗目的 (1)掌握分配層析的原理，學習氨基酸紙層析法的操作技術（包括點樣、平衡、展層、顯色）。 (2)學習樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。 二、實驗原理 (1)紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。當有機相流過固定相時，物質在兩相間不斷分配而得到別離。 (2)溶質在濾紙上的移動速度用比移值rf值表示。 (3)rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。 (4)在一定的條件下某種物質的rf值是常數。rf值的

6、大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法別離氨基酸。材料與方法 三、實驗裝置與試劑 (1)氨基酸標準液(1mg/ml) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標準液。 (2)80%甲醇 (3)0.1%茚三酮丙酮溶液 (4)氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/ml) (5)正丁醇 實驗儀器 (1)新華濾紙×1 (2)培養皿×1 (3)電熱鼓風枯燥箱×1 (4)吹風機×1 (5)毛細管×4 （6）針、線、尺×1 （7）鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)×1 實驗操作 (1)濾紙 選

7、用國產新華 1號濾紙， 6cm×7cm。在距濾紙2cm處劃線，用 鉛筆在線上標上四個點作為點樣位子（留出縫線空間）。 （2）點樣 點樣要適宜，樣品點的太濃，斑點易擴散或拉長，以致別離不清。用毛細管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣處的中心，這時樣品就自動流出。點樣的擴散直徑控制在0.5cm之內，點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴，為使樣品加速枯燥，可用吹風機吹干，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，影響定量結果。 將點好樣品的濾紙兩側比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。防止由于毛細管現象使溶劑沿兩邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響rf值。 (3)展

8、層 將揉成圓筒狀的濾紙放入培養皿內 (注意濾紙不要碰皿壁)，當溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時，取出濾紙，立即用鉛筆標出溶劑前沿位置。 酸溶劑系統： 正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml。溫度25，時間1h。 注意：使用的溶劑系統需新鮮配制，并要搖勻。 （4）顯色 待展層根本結束后, 置65鼓風箱中10-20min，鼓風保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點。 （5）rf值的計算 實驗六 紙層析法觀察轉氨基作用 【實驗名稱】：紙層析法觀察轉氨基作用 09救援一班 第三大組 李嵐宇 20xx222336 室溫：28° （一）實驗目的： 1、學習氨基酸紙層析的根本原

9、理。 2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。 （二）實驗原理： 轉氨基作用是氨基酸代謝過程中的一個重要反響，在轉氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸與-酮基的互換反響稱為轉氨基作用。轉氨基作用廣泛地存在于機體各組織器官中，是體內氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反響時均由專一的轉氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基轉移到另一酮基酸上。各種轉氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉移酶（alt）催化如下反響： 酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸 本實驗以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現，以證明轉氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，水被吸附在濾紙的纖維素

10、的纖維之間形成固定相。有機溶劑與水不相溶，把預別離物質加到濾紙的一端，使流動溶劑經此向另一端移動，這樣物質隨著流動相的移動進行連續、動態的不斷分配。由于物質分配系數的差異，而使移動速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速度就慢，反之，在流動相分配趨勢較大的成分，移動速度快，最終不同的組分彼此別離，物質在紙上移動的速率可以用比值rf表示： alt 物質在一定的溶液中的分配系數是一定的，故比值rf也相對穩定，因此在同一層析體系中可用rf值來鑒定被別離的物質。 （三）實驗材料與儀器： 試劑： 1、0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液。 2、0.2mol/l na2hpo

11、4溶液81ml與0.2mol/l nah2po4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。 3、0.1mol/l丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 n naoh仔 細調至ph7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。 4 、0.1mol/l酮戊二酸稱取酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 n naoh仔細調至ph 7.4 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。 5、0.1mol/l 谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/lph 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 n na

12、oh仔細調至ph 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。 7、層析溶劑：將重蒸過的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時后分層，將下部酚層轉移到瓶中備用。 儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養皿、外表皿、沸水浴鍋、37恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術剪刀、分液漏斗。 （四）實驗步驟: 1、肝勻漿制備：取新鮮動物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,參加冷0.01mol/lph 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿， 用上述緩沖液4.5ml混勻備用。 2、 酶促反響過程 （1）取離心管兩支，編號：

13、1（測定管）、2（對照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。 （2）各加0.1mol/l丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/l-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。 （3）37保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。 （4）把測定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過濾。 3、層析 （1）取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點為中心，約1 cm為半徑,用鉛筆劃一圓線作為基線,在線上四等份處標清四點編號作為點樣原點。 （2）點樣：用四根毛細玻璃管分別進行點樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點在原點2、4處。把測定液、對

14、照液分別點在原點1、3處。注意斑點不宜過大（應在直徑0.5cm以下）。在第一次點樣點干后，再在原處同樣點第2次。 （3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。 （4）把濾紙平放在上述培養皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養皿蓋。可見層析液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周擴散。當層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。 （5）顯色：將上述濾紙平放在培養皿上，滴0.5茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤，再放入烘箱枯燥，此時可見紫色斑出現，比擬色斑的位置，及色澤深淺，計算rf值，分析是否發生了轉氨基反響。 （五）實驗結果記錄： （六）實驗討論： 1、從表格（