1、精選學習資料 - - - 歡迎下載蛋白免疫印跡雜交（western blot、 wb ）wb 為將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分別,再轉移到雜交膜上, 然后通過一抗 /二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法；wb為進行微量蛋白質分析比較成熟的技術之一；以下為總結western blot操作方法及常見問題分析,有助于勝利完成 wb ；a 第一部分：蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備為 western blotting的第一步, 更為打算 wb 成敗的關鍵步驟, 總體原就和留意事項：1. 盡可能提取完全或降低樣本復雜度只集中于提取目的蛋白（通過采納不同提取方法或挑選不同的試劑盒產品）；2. 保

2、持蛋白處于溶解狀態（通過裂解液的ph .鹽濃度.表面活性劑.仍原劑等的挑選）；3. 提取過程防止蛋白降解.集合.沉淀.修飾等,（低溫操作,加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；4. 盡量去除核酸, 多糖, 脂類等干擾分子 （通過加入核酸酶或實行不同提取策略）；5. 樣品分裝,長期于 -80中儲存,防止反復凍融；方法的挑選自行配制抽提試劑,依據文獻方法或體會提取；購買商品化試劑盒,按其說明書的方法提取；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載example 1 ：試驗中提取腎臟總蛋白,詳細試驗過程如下：1. 提前一天 4解凍 ripa,肯定要完全融解；配pbs（用于細胞試驗就需高壓） ；2.

3、配制裂解液： pmsf:ripa=1:99、pmsf 終濃度為100mm（依據樣本數配制所需 的量,臨用臨配）；3. 裂解組織：每個樣品稱取100mg,加 1ml 裂解液,勻漿后4靜置 2h 使其充分裂解, 14000g,4離心 10min,取上清；4. 蛋白定量：取少量上清稀釋30 倍蛋白定量,然后運算出各樣本原液蛋白濃度； 留意由于裂解液里含有較高濃度的洗滌劑,蛋白定量不能選用bradford 法,可以選用改良的lowry s 法或者 bca 法；5. 樣品蛋白濃度均一化：依據蛋白定量運算的結果將各樣品蛋白濃度調整一樣；詳細方法為加入pbs 稀釋至樣品濃度一樣,本次蛋白濃度為3mg/ml

4、；6. 分裝并存于 -80,防止反復凍融；b其次部分：相關試劑的配制：1. 10% 的 sds（戴口罩稱取）：稱取 sds10g,先加雙蒸水 80ml ,再用磁力加熱攪拌助溶,然后定容至100ml； 室溫儲存,如在長期儲存中顯現沉淀,可在50水浴溶化后,仍可使用；2. 1.5m tris/hcl （ ph8.8）trisbase 18.17g,溶解于 80ml 雙蒸水,用濃鹽酸調 ph 至 8.8,最終定容至 100ml,室溫下儲存；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載3. 0.5m tris/hcl （ ph6.8）trisbase 6.06g,溶解于 80ml 雙蒸水,用濃鹽酸調

5、 ph 至 6.8,最終定容至 100ml, 室溫下儲存；4. 30% 丙烯酰胺 /0.8% n、n-亞甲丙烯酰胺丙烯酰胺（ acr）75g甲叉雙丙烯酰胺2g加雙蒸水 150ml,37加熱溶解后,定容至250ml,查證該溶液ph 應不大于7.0,4棕色瓶儲存；使用時復原至室溫且無沉淀；be careful.：丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸取,其作用具有累積性；稱量丙烯酰胺和n、n-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和口罩；可認為聚丙烯酰胺 無毒,但也應謹慎操作,由于它仍可能含有少量未聚合材料；5. 上樣緩沖液0.5mm trisbaseph6.82.5ml甘油2.0ml10sds4.0ml0.4

6、%溴酚藍（ mw669.97）1ml 二巰基乙醇（ mw78.14）0.5ml 注：配好后分裝 -20儲存；6. 電泳緩沖液10 倍儲存液1 倍應用液trisbase30g3g甘氨酸144g14.4g sds10g1g加水至 1000ml,ph 值用 hcl 調 8.3；已經配制了 1000ml 的儲存液；電泳緩沖精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載液用應老師的電泳槽應用液300ml；用 10 倍的儲存液 30ml 加入水 270ml；7. 轉移緩沖液（臨用臨配,鐵盒子里攪拌混勻并4預冷）：0.606g2.88g160402002.424g11.52g640160800tris ba

7、se甘氨酸h2o（ml ）甲醇（ ml ）終體積（ ml）2 板膠轉移緩沖液的用量約為200ml；8. 洗滌緩沖液（ tbs）10 倍儲存液1 倍應用液tris base24.2g2.42gnacl80g8g加水 800ml,用 hcl 調整 ph 為 7.6,再加水至 1000ml,已經配制了 1000ml 的 tbs 液,臨用時再加 0.1%的 tween-20；一般做兩板膠要用洗滌緩沖液 500ml； 用儲存液 50ml 加入 450ml 水,后加 0.5ml tween-20；9. 封閉緩沖液（ 5% 脫脂奶粉） 10ml/膜脫脂奶粉2g洗滌緩沖液40ml兩板膠 4 張膜要用封閉緩沖液

8、40ml；詳細試驗步驟：預備：預備器材： 10%過硫酸銨；冰盒；預熱恒溫加熱器；拿出試劑（雙丙和temed提前從冰箱拿出平穩,否就凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡）；電泳儀器； 洗潔凈的板子和梳子； 濾紙條用于吸水； 剪刀；尺子；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載剪好的膜（依據目的蛋白分子量以及樣品個數打算）及比膜稍大些的潔凈濾紙；脫脂奶粉；潔凈的裝封閉液的容器約50ml 大小；提前清洗玻璃板并晾干：留意不要用清潔球之類的粗糙物品清洗玻璃板,可用洗潔精泡約 2h,用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗潔凈,置于架子上晾干；做膠分別膠：1. 先稱取過硫酸胺,配兩板

9、膠用10的過硫酸胺150l ,一般要稱取過硫酸胺 0.2-0.3mg,溶解到相應量的雙蒸水中,混勻；分別膠（括號里為2 板膠的用量）試劑7.5101215 水ml4.9 7.354.16.153.45.12.43.6ml1.5mtris/hclph=8.82.53.752.53.752.53.752.53.75丙/雙丙烯酰胺2.53.753.34.954.06.05.07.510%sds100、150100、150100、150100、150精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載10%過硫銨 l50、7550、7550、7550、75精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載tem

10、ed10、1510、1510、1510、15適用蛋白分子量100kda60-100kda20-60kda20kda精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載玻板間夾上膠條,用夾子將兩塊玻板夾緊；按以上方法配膠,加入temed后立刻搖勻即可灌膠；灌膠時,可用10ml槍吸取 5ml膠沿玻璃放出,將膠加入到玻璃板的夾層中；加入的量略高于夾子的最高處（或者膠面升到綠帶中間線高度時即可）加好后加入1ml 的水壓膠；做分別膠時,凝固時間大約為2540 分鐘,要依據溫度來確定；一般可以依據剩下在離心管中的膠的凝固情形來確定膠的凝固；當水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了；再等3min 使膠充分凝固就可

11、倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干；留意：舊的 1.0mm 的板子短的玻璃在里面,新的在外面；過硫酸銨一般現配現用；留意各種試劑加入的次序, “三大三小”,后面加過硫酸銨,最終加temed ；配制過程中每加入一種試劑要充分混勻,防止膠顯現濃度不均的情形；要依據溫度調整temed 的使用量；夏天凝聚的快,冬天凝聚的慢；冬天假如凝聚的慢,兩板膠可以加temed 20-30 l；水封的時候水要漸漸加入,太快會導致膠面不平,封膠后切記勿動；膠通常在 0.5 1h 內凝集最好,過快膠太硬易龜裂,而且電泳時簡單燒膠；下一步試驗預備a 預備樣品：1預熱微量恒溫器（ 98）；2預備一套中 ep 管并標記 ,以用于

12、混勻樣品和上樣緩沖液；3取出樣品,marker,上樣緩沖液 置于冰上；4樣品：上樣緩沖液 =3:1 混勻,置于微量恒溫器上98 5min 變性； b 配 制 電 泳 緩 沖 液 ； c配 4濃縮膠, temed 臨用時加；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載濃縮膠（括號里為2 板膠用量）水3.00ml4.5ml0.5mtris/hclph=6.81.25ml1.875ml丙/雙丙烯酰胺（30%/0.8%）0.67ml1.005ml10%sds50l75l過硫酸胺（ 10）50l75ltemed5l15l膠凝固后, 快速向上將梳子拔下, 將玻璃板夾上電泳架, 完整的玻璃板在外圍；電泳槽

13、中倒入電泳緩沖液（約 300ml）；加足夠的電泳液后開頭預備上樣； （電泳液至少要漫過內側的小玻璃板） ；留意：濃縮膠的加入很重要,由于其硬度比分別膠小,而且仍要加入梳子,把握其凝固的時機很重要；太遲膠要粘住梳子,太早膠凝固不好；用bio-rad 的玻璃板用temed 15 l ,在溫度為 22時凝固的時間為10 分鐘左右, 溫度再高一些可以達到89 分鐘,低一些可以延長一些；膠的凝固很快,主要為加入temed 后的動作要快速,以免在離心管中凝固了；加入的量要與玻璃板的最高線平行；灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生；插梳子時要使梳子保持水平；由于膠凝固時體積會收縮減小,從而使加樣孔的

14、上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過程中要經精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載常在兩邊補膠（其實說常常有點過了,補12 次就行了,不補膠問題也不大） ；待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出；插梳子要用力勻稱,一次成型,且要留意梳子插入時哪面朝內哪面朝外；加樣（加變性后的樣品）：用微量進樣器或加樣吸頭吸入樣品20l,加入到加樣孔中；用微量進樣器貼壁吸取樣品, 將樣品吸出時不要吸進氣泡； 將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品；（加樣太快可使樣品沖出加樣孔, 如有氣泡也可能使樣品溢出； ）加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3 次,以免交叉污染；在第一孔

15、和最終一孔加20l 上樣緩沖液以防止邊緣效應, 其次孔加 3l marker,其他孔加 20l 樣品（樣品加樣 20-30 l 都可以,但不超過 30l、 加樣量取決于蛋白濃 度）,保證每個上樣孔蛋白濃量為30-50 g；電泳：100v,電泳 2 小時,電泳時要留意電泳槽上的電泳緩沖液的量,較少時,要從下槽中吸取一部分轉移到上槽；有時電泳的時間用不到2 小時,要依據溴酚藍的位置確定為否要停止電泳；通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處鄰近即可停止電泳；轉膜：蛋白因結合sds 而帶電荷,在電場下從膠中轉至膜上,轉膜操作根椐電轉儀制造商的說明書進行轉膜方式分為半干和濕轉兩種,半干式轉膜速度快,而濕式成 功

16、率高并特殊適合用于分子量大于100 kda 的蛋白；要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反復撬；撬一會兒玻璃板便開頭松動,直 到撬去玻板；（撬時肯定要當心,膠很易裂,要用巧勁）除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作） ,要防止把分別膠刮破；當心剝下分別膠蓋于濾紙上,用手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡；將膜蓋于膠上,要蓋滿整個膠,精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載（膜蓋下后不行再移動）并去除氣泡；預備：1. 電泳期間,剪好濾紙和膜,寬度由marker 及目的蛋白分子量確定,長由加樣孔數打算；2. 配置轉膜緩沖液并預冷；3. pvdf 膜用甲

17、醇活化 （目的為為了活化pvdf 膜上面的正電基團, 使它更簡單跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也為這個目的）；半干法轉膜：電泳完畢后,用卡片從一角的縫隙撬下一塊玻璃板,留意用力適度,用刀將沒用的膠切除：濃縮膠,加樣孔以外的膠,和溴酚藍下方的膠；先將pvdf 膜和海綿泡在轉移緩沖液中,將pvdf 膜做好標記：剪刀剪下其一邊的兩角,一大,一小； 將上述東西置于半干轉膜儀器上,“三明治”從下往上的次序依次為：（）濾紙 -膠-膜-濾紙（）；用電轉緩沖液略微潤濕,轉膜100ma 1.5h；留意防止轉膜時電源插反；濕法轉膜：“三明治”從下往上的次序依次為： 海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海

18、綿,三明治安放的方向確認正確, 負極方為帶負電的膠里的蛋白,向正極方（膜） 的電遷移；100ma 轉膜一個半小時即可；夾的黑面對槽的黑面,夾的白面對槽的紅面；電轉移時會產熱,在槽的一邊放一塊冰來降溫；蛋白帶負電,膜要靠近正極精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載留意：1. 防止用手直接接觸膜,應使用鑷子,手指上的油脂與蛋白會封閉轉膜效率并易產生背景污斑；2. 用卡片把玻板撬開時留意用力要輕以免損壞玻板；3. 把膠從玻板上剝離時要保持膠的完整性,以及膠和膜之間不能有氣泡；如有氣泡就可用小玻棒輕輕滾下趕走氣泡；4. 濾紙膠膜之間的大小,一般為濾紙膜膠；5. 轉膜前要在轉膜緩沖液里平穩一下防

19、止膠變形,也有助于進一步去掉可能有礙于轉膜的雜質；仍有人在這一步浸泡幫忙蛋白復性,可以直接在膠上檢測蛋白活性；封閉：轉膜完成后,將膜從轉膜夾中取下,將膜用tbs 從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1h；留意要將 貼膠的一面朝上（正面）的放在封閉盒子中,加入封閉液；4過夜；留意：假如選用 ap 作為顯色方法,封閉時就要挑選tris 緩沖系統,不要用 pbs,由于 pbs 滋擾 ap；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載洗脫 （10mim/次,洗脫 3 次） ：其次天,將封閉液倒掉,加入洗脫緩沖液,室溫下搖10 分鐘,倒掉；再加入洗脫緩沖液,室溫下搖10 分

20、鐘,倒掉；加入洗脫緩沖液,搖10 分鐘,倒掉；一抗孵育：預備：拿出配制抗體的新管子并標記（抗體名稱,稀釋比例,配制日期及全部人）；抗體的稀釋：用洗脫緩沖液稀釋eg.1:200,就 10l 加 2ml 洗脫緩沖液；一抗原液用之前要12000rpm 離心 20s 或者用手輕彈使蛋白混勻；步驟：加入一抗每小盒 2ml（皿用 5ml）,室溫下搖動孵育2 小時；2h 后回收一抗 ；洗脫：步驟同前（ 10mim/次,洗脫 3 次）；二抗孵育：預備：拿出配制抗體的新管子并標記（抗體名稱,稀釋比例,配制日期及全部人）；二抗的稀釋直接依照稀釋倍數用洗脫液稀釋；二抗原液用之前要12000rpm 離心 20s 或者

21、用手輕彈使蛋白混勻；步驟：加入二抗每小盒 2ml（皿用 5ml）,室溫下搖動孵育2 小時；1h 后回收二抗 ；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載洗脫：步驟同前（ 10mim/次,洗脫 3 次）,留意洗第三遍后,不要立刻將洗脫緩沖液倒掉；顯影：辣根過氧化物酶hrp-ecl發光法：1) 配置顯影液： 2 張膜配 a 和 b 液各 700l 并混勻；2) 預備 u 盤或者刻錄盤, 1000 槍,槍頭,籃子,方蓋子,鑷子,濾紙,1.5ep管,顯影液；3) 將膜從盒中夾出, 濾紙貼角吸干, 正面朝上平整的放在方蓋子里, 將顯影劑用槍打到膜上,盡量不要讓膜在盒子里移動,勻稱的在膜上澆顯影液 3

22、 5min,倒掉顯影液,并用濾紙拭干四周；4) 把膜放入機器（正面朝上） ,打開電腦, snap軟件,此時再推動機器,按鈕變成藍色,界面中間部分有2 個圖標,左邊為單個拍照,時間在其下調試；另一個為連續拍照, 點擊圖標后輸入曝光時間 （舉薦 30s,可跟據試劑情形延長到幾分鐘）,3 次即可,顯影后,另存為as,再儲存張 export as tiff格式；ap-nbt/bicp顯色法：原理：本試劑盒采納 bcip 和 nbt 為底物,可由標記于二抗上的ap 催化,產生化學顯色反應,在蛋白轉印膜陽性蛋白條帶處形成藍紫色沉淀,適用于使用 ap 標記抗體的 western blot；與化學發光類試劑相

23、比,本產品使用便利,可快速獲得結果；但檢測靈敏度不及化學發光類試劑；使用方法：用平頭鑷子將膜取出,膜的下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上余外的漂洗液；正面朝上平整的放在潔凈的方蓋子上,將顯影劑用槍勻稱澆到膜上,盡量不要讓膜在精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載盒子里移動,并用不透亮物體（如報紙）遮擋光線,室溫孵育515min,顯色 20s后每 10s 觀看一次,至條帶明顯或有本底顯現時用蒸餾水洗滌12 次即可終止顯色反應,放濾紙上晾干即可觀看與掃描；精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載wb過程中常見的問題及可能緣由分析問題可能緣由驗證或解決方法膜沒有完全勻稱濕透使用 100% m

24、ethanol 浸透膜挑選小孔徑的膜,縮短轉移精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載轉膜不充分靶蛋白分子量小于10、000靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液 ph值甲醇濃度過高時間可嘗試使用其他緩沖液如caps緩沖液（ ph 10.5 或使用低 ph 值緩沖液如乙酸緩沖液過高甲醇濃度會導致蛋白 質與 sds分別,從而沉淀在凝膠中,同時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉移；降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代 替精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載轉移時間不夠 thick gel對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間膜沒有完全勻稱濕透使用 100% methanol

25、浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數增加封閉液孵育時間,或者提高溫度；挑選合適的封閉精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載背景高阻斷不充分試劑（脫脂奶粉,bsa,酪蛋白等）精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載二抗濃度過高降低二抗濃度保證充分的反應液,防止出精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載檢測過程中膜干燥現干膜現象精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載曝光過度縮短曝光時間精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載抗體與阻斷蛋白有交叉反應檢測抗體與阻斷蛋白的交 叉反應性,挑選無交叉反應的封閉劑 ；洗滌液中加

26、入tween-20 可削減交叉反應精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載沒有陽性條帶抗體染色不充分酶失活標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低試劑不匹配增加抗體濃度,延長孵育時間直接將酶和底物進行混合,假如不顯色就說明酶失活 了；挑選在有效期內.有活性的酶聯物設置陽性對比,假如陽性對比有結果,但標本沒有就可能為標本中不含靶蛋白或 靶蛋白含量太低；可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白 含量低的緣由；一抗與組織種屬,一抗與二抗或 / 和底物與酶系統之間不匹配；通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有 效性精品學習資料精選學習資料 - - - 歡迎下載一抗失效挑選在有效期內抗體；并挑選現配現用的工作液所用溶液和容器中防止含精品學