1、變性梯度凝膠電泳dgge劉琳1131428環境科學一、實驗目的1. 學習掌握變性梯度凝膠電泳的原理和方法。2. 練習變性梯度凝膠電泳的操作步驟。3. 分析并掌握變性梯度凝膠電泳的思路，并了解其在微生物群落研究屮的地位。二、實驗原理雙鏈dna分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。 不同長度的dna片段能夠被區分開，但同樣長度的dna片段在凝膠中的遷移行為一樣，因此 不能被區分。dgge技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺） 梯度，從而能夠把同樣氏度但序列不同的dna片段區分開來。不同的雙鏈dna片段因為英序列組成不一樣，所以其解鏈區域及各解鏈

2、區域的解鏈溫度 也是不一樣的。同樣長度但序列不同的dna片段會在膠屮不同位置處達到各自最低解鏈區域 的解鏈溫度，因此它們會在膠中的不同位置處發生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在 膠屮被區分開來。然而，一旦溫度（或變性劑濃度）達到dna片段最高的解鏈區域溫度時, d7a片段會完全解鏈，成為單鏈dna分子，此時它們又能在膠中繼續遷移。因此，如果不同 dna片段的序列差異發生在最高的解鏈區域時，這些片段就不能被區分開來。d7a片段在dgge膠中的遷移行為（如下圖）：變性劑 i口s-sajoudot5石ds dnapartial sslowi i i h丨i i h丨丨丨ii 1 1 ii i i

3、 i ii i i i iss dnahigh在dna片段的一端加入一段富含gc的dna片段（一般30-50個堿基對），使dna片段最 高的解鏈區域在gc夾子這一段序列處，它的解鏈溫度很高，可以防止dna片段在dgge/tgge 膠中完全解鏈。當加了 gc夾子后，dm片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區分開 （myers, 1985）。dgge有兩種電泳形式：垂直電泳和水平電泳。垂直電泳是為了確定變性劑梯度；而水 平電泳則是對比分析不同樣品的微生物差異。本次試驗做的是水平電泳，主要對比分析不同 樣品的微生物差異。三、實驗器材與藥劑器材：dgge system （d-code, bio-ra

4、d） 移液管、移液槍、槍頭、制膠設備、30ml針筒、 聚乙烯細管、電泳儀試劑：16s rdna v3 |x pcr擴增產物、膠濃度為8%變性劑濃度分別為0%和90%丙烯酰胺膠、 50xtae buffer、去離子甲酰胺、尿素、去離子水、10%過硫酸鞍（aps）、temed、sdna染料四、實驗步驟1. 首先按照實驗要求將50x tae buffer稀釋為1 xtae buffer,并利用90%和0%的變性膠 分別配置15. 5ml的35%和55%的變性膠溶液。其中35%的變性溶液需要加入6ml 90%的 變性膠溶液和9. 5ml的0%的變性膠溶液；55%的變性溶液需要加入9. 5ml 90%的

5、變性膠 溶液和6ml的0%的變性膠溶液。2. 將海綿墊固定在制膠架上，把類似'三明治'結構的制膠板系統垂直放在海綿上方，用 分布在制膠架兩側的偏心輪固定好制膠板系統，注意一定是短玻璃的一面正對著自己。 將三根聚乙烯細管中短的那根與y形管相連，兩根長的則與小套管相連，并連在30ml 的注射器上。在兩個注射器上分別標記'高濃度'與'低濃度'，并安裝上相關的配件; 反時針方向旋轉凸輪到起始位置。將體積設置顯示裝置固定在注射器上并調整到fi標體 積設置（15.5）。配制兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液到兩個離心管屮，每管加入12 ul temed, 80 u1

6、 10% aps,迅速蓋上并旋緊帽后上下顛倒數次混勻。將兩種變性溶液分 別吸入相應注射器中。通過推動注射器推動桿小心趕走氣泡；分別將高濃度、低濃度 注射器放在梯度傳送系統的正確一側固定好，再將注射器的聚丙烯管同y形管相連，輕 柔并穩定地旋轉凸輪來傳送溶液，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝膠板中，灌完 后插上梳子，迅速清洗用完的設備。3. 待膠干后，在梳孔屮加入相應樣品，z后在75v的條件下電泳20h。4. 在200ml ixtae中加入30ul sdna染料（或20ul 1%eb ）,混勻后小心倒入一容器中； 撥開一塊玻璃板，將膠（帶著一塊玻璃板）放入容器屮；輕輕晃動玻璃板，使膠與玻璃 板脫

7、落，置水平搖床輕輕搖晃染色20mino5. 利用生物電泳分析系統對染色后的膠進行拍照。五、實驗結果記錄并整理如圖所示，在紫外透射儀的觀察下，可明顯發現跑出很多條條帶。上而和底部兒乎沒 有明顯條帶出現，條帶顯示居中下，說明變性膠的濃度范圍可以適當縮小。這樣可以更好地 分離中間較為集中的條帶。在同一水平方向上，有些條帶亮度呈依次增強的趨勢，這表明該微牛物在水凈化處理系 統中依次增加；條帶亮度不變的表明，該微生物的數量并沒有變化；條帶亮度依次減弱，表 明該微生物已經不適應系統屮的環境，數暈在逐漸減少。在膠的下半部分，條帶z間的間隔 比較小，有些辨別不清楚，這可能與電壓較小且電泳時間過長有關。左邊的純

8、菌種跑出了四 條條帶，表明有些純菌種可以跑出多條條帶的。右邊也是純菌種，理論上應該只有一條條帶, 但結果有很多條，可能是實驗操作時出現了污染。六、思考1. 實驗過程屮需要注意些什么細節？1）配制試劑時一定要用去離子水2）在混合和灌膠吋應避免產生氣泡。3）制膠是關鍵。玻璃板一定要洗干凈，在灌膠時，要勻速的轉動滑輪，將凝膠液勻速的灌入 玻璃板中，液面要保持水平。4）灌完膠后要立即清洗注射器，以防膠凝固，堵塞管子.5）點樣時，要用小型注射器，伸入點樣孔底部點樣6）每次用完儀器后要及時清理，玻璃板一定要清洗干凈，放置妥當。2. 通過這個實驗你有什么收獲？這個實驗對你今后開展相關實驗研究是否有幫助？變性

9、梯度凝膠電泳（dgge）讓我了解到現在微生物群落的研究方法的先進性，在分子生 物學的研究屮具有重要的意義。變性梯度凝膠電泳可以區分不同群落屮微生物的種類。而且, 此次實驗對今后的畢業論文課題開展奠定了良好的基礎。3. 如果你在做dgge實驗吋得到的指紋圖譜的所有條帶都在凝膠的上端，可能是什么因素 導致的，你怎么來解決這個問題？實驗前做什么樣的準備工作可以避免這樣的結果出現？可能導致的原因有： 變性劑濃度過大，雙鏈dna開始電泳后立即部分裂解為單鏈后，始終保持較小的電泳速 度，因而導致結果偏上。 電泳吋電壓過低，導致電泳速度影響條帶位置。 電泳時間太短。 gc濃度不理想。解決措施 適當降低變性劑的濃度 增加加電泳電壓 加長電泳時間4.