1、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在 內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 %的染色 體DNA在Ca告和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,在核小體單位之間被隨機(jī)切斷, 形成180200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而 產(chǎn)生的一系列DNA的3' -OH末端可在脫 氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT的作用下, 將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖

2、 核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL。由于正常的或正在增殖的細(xì) 胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-0H形成，很少能夠被染色。低分 子量的 DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation，使低分子量的 DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué) 與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色 ， 能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、 冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞 和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極 少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織

3、化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋 亡的研究中已被廣泛采用。一、過(guò)氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法原理:脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin -11-dUTP在TdT酶的作用下 可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈 DNA的3-OH末端,與dATP形成異多聚體,并可 與連接了報(bào)告酶（過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的抗地高辛抗體結(jié)合。 在適合底物存在 下,過(guò)氧化物酶可 產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可 在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來(lái)源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛 杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反

4、應(yīng) 不到1%,若此抗體的Fc部分通過(guò)蛋白酶水解的方法除去后，則可完 全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從 組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。檢測(cè)晚期凋亡?；驹恚簩?duì)不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性,然后讓rTDT和bio標(biāo)記的 dTUTP進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)，在rTDT的輔助下dTUTP與核斷裂的DNA 3' -OH結(jié)合,再用 HRP標(biāo)記的鏈霉親和素與dTUTP上biotin結(jié)合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結(jié)合 3 個(gè)biotin分子,最后用DAB、過(guò)氧化氫與SP上的辣根過(guò)氧化物酶HRP發(fā)生氧 化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐

5、色,最終通過(guò)計(jì)數(shù)每張切片上不同視野 中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。羅氏試劑盒一、試劑1、酶濃縮溶液5X 50卩l(xiāng) 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（10試劑2、標(biāo)記溶液5X 550卩l(xiāng) 含有核苷酸混合液的反應(yīng)液（1試劑3、轉(zhuǎn)化劑-POD 3.5ml酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型,融后4C保存二、所需的溶液和儀器10mM Tris/HCI（pH7.47.8、PK 配制、DAB、飯盒、吹風(fēng)機(jī)、 3%H2O2 甲醇 溶液、PBS、蓋玻片、中性樹膠、蘇木素、二甲苯和無(wú)水乙醇（用量多、雙蒸水 （用以配梯度酒精1,充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60度20mi n，石蠟切片于染色缸 中，二甲苯浸洗 2

6、次共 5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗 3min >5; 3%過(guò)氧化氫甲醇中浸洗10-15min，抑制內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。 用蛋白酶K （20卩g/m溶于Tris/HCl中,pH7.48.0室溫孵育1530分鐘 PBS洗約5min*2次,擦干樣品周圍的水。此階段配制 TUNEL反應(yīng)混合物一 從試劑2中取出100卩標(biāo)記溶液作為兩個(gè)陰性對(duì)照；將試劑1中取5卩I試劑2中 45卩標(biāo)記液中,配成50卩I TUNEL反應(yīng)混合物混勻（即配即用4C避光！ 標(biāo)記反應(yīng)：滴加50卩的TUNEL反應(yīng)混合液,在濕盒中37C孵育60分鐘（為防 蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，可以在孵

7、育過(guò)程中加蓋蓋玻片。PBS洗 5min*3次，至此樣品可在熒光鏡下（綠色分析結(jié)果。 信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析：擦干樣品周圍的水分，加入50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，濕盒中37C孵育2030分鐘（可以在孵育過(guò)程中加蓋蓋玻片。PBS洗5min*35次 加入50100卩l(xiāng) DAB底物溶液，室溫（1025C孵育510 min , PBS洗5min*3 次。（蘇木素染1-3秒,以免視野全染，需要摸索條件 中性樹膠 或者甘油封片（在封片前可以復(fù)染，光鏡下分析結(jié)果。？穩(wěn)定性:TUNEL反應(yīng)混合物需在使用前立即制備，不能儲(chǔ)存,配好的此液體必須將放入冰 浴中。2、轉(zhuǎn)化劑-POD （即用型:一旦融化此液體，需在4C保存（最多保存

8、6個(gè)月，并且 不能反復(fù)凍存。蛋白酶K 一般工作液濃度為20ug/ml,但濃縮液可配制110mg/ml,可用PBS配 制,也可用蛋 白酶K緩沖液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA;1蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長(zhǎng)孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落（come off the slide ,所以要最優(yōu)化孵育時(shí)間長(zhǎng)短。時(shí)間一般為1030 min , 4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min,最終通過(guò)摸索最佳時(shí)間。過(guò)長(zhǎng)易脫片、過(guò)短 起不到通透效果。2對(duì)于比較困難的組織，可以選用0.1M pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液 進(jìn)行修復(fù)（石蠟切片無(wú)必 要用,200ml

9、需350W修復(fù)5min3對(duì)照:陰性對(duì)照：經(jīng)過(guò)固定和通透的細(xì)胞樣品加入 50卩試劑2以代替TUNEL 反應(yīng)混合 物,從標(biāo)記步驟以下同上。陽(yáng)性對(duì)照：經(jīng)過(guò)固定和通透的細(xì)胞樣品用細(xì)球菌 的核酸酶或DNase I使之產(chǎn)生DNA鏈缺口 ,從標(biāo)記步驟以下同上。4操作流程:常規(guī)脫蠟、脫水處理一一沖洗樣品一一滴加TUNEL反應(yīng)混合 物,37C孵育60分鐘一一沖洗樣品一一選擇:熒光鏡下觀察分析一一滴加轉(zhuǎn)化劑- POD , 37C孵育30分鐘一一洗樣品一一滴加DAB底物溶液，室溫孵育5-20分鐘一 光鏡下分析結(jié)果5假陽(yáng)性多的原因有很多:POD封閉不全、DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因假陽(yáng)性嚴(yán) 重，可能原因 應(yīng)該是DAB孵育

10、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議首先排除之，同時(shí)加強(qiáng)PBS浸洗6DAB顯色時(shí)間：(1 DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底 時(shí)即可沖洗；(2 DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你 的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間(3此外,若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全 需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；(4 DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如超過(guò)十幾分鐘才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的 抗體濃 度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短(最好一抗4度過(guò)夜;另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。7脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片：(1多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說(shuō)也是不錯(cuò)的，可是都脫 成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)(2組織切的