1、第九章 葡萄糖氧化酶（GOD）Glucose Oxidase，簡稱，簡稱GOD，-D-葡葡萄糖：氧萄糖：氧 氧化還原酶；氧化還原酶；EC1.1.3.4）是）是一種需氧脫氫酶，能一種需氧脫氫酶，能專一地氧化專一地氧化-D-葡葡萄糖萄糖成為葡萄糖酸內(nèi)酯。成為葡萄糖酸內(nèi)酯。 1928年由Muller首先從黑曲霉（Aspergillus niger）的無細胞提取液中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶。隨后有人分別從青霉（P.Variable）和黑曲霉中提純葡萄糖氧化酶。 其他霉菌，象米曲霉和點青霉也能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶，然而在高等植物和動物體內(nèi)還沒有發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶。一、 葡萄糖氧化酶催化的反應 葡萄糖氧化酶的催化反應，

2、按條件不同有如下三種形式： 在沒有過氧化氫酶存在下，每分子葡萄糖氧化酶氧化時消耗1分子氧。C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2 在有過氧化氫酶存在下，每分子葡萄糖氧化酶氧化時消耗1原子氧。C6H12O6 + 1/2O2 C6H12O7 在有乙醇和過氧化氫酶存在下，過氧化氫同時被用于乙醇的氧化作用，此時，每分子葡萄糖氧化酶氧化時消耗1分子氧。C6H12O6 + C2H5OH + O2 C6H12O7 + CH3CHO + H2O二、葡萄糖氧化酶的催化特異性 葡萄糖氧化酶對-D-吡喃葡萄糖表現(xiàn)出高度的專一性。葡萄糖氧化酶底物分子C1上的羥基在酶的催化作用中起到重要作用

3、，且羥基處在-位時酶的活力比處在-位時高約160倍。底物分子中的任何一點改變都會顯著降低其氧化速率。OHO HHHHHO HOHOHO HEF A DOO HHHHHOHOHO HO+EF A D H 2O2EF A D+H2O2H2OO HO HO HHHHHCOOHOHOHO HH -D-葡 萄 糖 酸 內(nèi) 酯D-葡 萄 糖 酸葡萄糖氧化酶的底物特異性葡萄糖改性的位置葡萄糖改性的位置化合物化合物同同-D-D-葡萄糖的差別葡萄糖的差別相對酶活相對酶活-D-D-葡萄糖葡萄糖1001001 1-D-D-葡萄糖葡萄糖C C1 1上上OHOH的構型的構型0.640.641 11,5-1,5-脫水脫水

4、-D-D-葡萄糖葡萄糖醇醇C C1 1上上OHOH被被H H取代取代0 02 22-2-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖C C2 2上上OHOH被被H H取代取代3.33.32 2D-D-甘露糖甘露糖C C2 2上上OHOH的構型的構型0.980.982 22-O-2-O-甲基甲基-D-D-葡萄糖葡萄糖C C2 2上上OHOH的的H H被甲基取代被甲基取代0 03 33-3-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖C C3 3上上OHOH被被H H取代取代1 14 4D-D-半乳糖半乳糖C C4 4上上OHOH的構型的構型0.50.54 44-4-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖C C4 4上上OHOH被被

5、H H取代取代2 25 55-5-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖C C5 5上上OHOH被被H H取代取代0.050.055 5L-L-葡萄糖葡萄糖C C5 5上上CHCH2 2OHOH的構型的構型0 06 66-6-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖C C6 6上上OHOH被被H H取代取代0 06 6木糖木糖C C6 6被被H H取代取代0.980.98三、葡萄糖氧化酶的分子組成及其作用機制 葡萄糖氧化酶以黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔基，來源不同，其分子量亦有所差別。 目前葡萄糖氧化酶的工業(yè)酶制劑主要來源于黑曲霉，因此黑曲霉葡萄糖氧化酶是這類酶中研究得最為徹底的一種。黑曲霉葡萄糖氧化酶分子

6、量為160000左右。 實驗數(shù)據(jù)證明，葡萄糖氧化酶催化的反應的速度同時取決于O2 和葡萄糖的濃度，反應遵循乒乓機理，可以用下面的圖表來表示： 圖中G和L分別代表-D-葡萄糖和-D-葡萄糖酸內(nèi)酯。也可以用下式描述葡萄糖氧化酶催化的反應：OHOHHHHHOHOHOHOHEFADOOHHHHHOHOHOHO+EFADH2O2EFAD+H2O2H2OOHOHOHHHHHCOOHOHOHOHH-D-葡萄糖酸內(nèi)酯D-葡萄糖酸 反應中，氧化態(tài)酶EFAD作為脫氫酶從-D-葡萄糖分子中取走兩個氫原子形成還原態(tài)酶EFADH2和-D-葡萄糖酸內(nèi)酯，隨后-D-葡萄糖酸內(nèi)酯非酶水解成D-葡萄糖酸，同時還原態(tài)葡萄糖氧化酶

7、被分子氧再氧化成氧化態(tài)葡萄糖氧化酶。如果反應體系中存在過氧化氫酶，那么H2O2被催化分解成H2O和O2。四、 溫度對葡萄糖氧化酶作用的影響 葡萄糖氧化酶催化反應需要氧的參與，反應溫度改變將導致反應體系中氧的濃度發(fā)生改變，從而影響酶活性。溫度升高時，反應體系中氧的溶解度下降，這就抵消了溫度升高對酶反應速度的影響。 葡萄糖氧化酶催化的反應具有較低的Q10； 在一定溫度范圍內(nèi)（3060），溫度變化對葡萄糖氧化酶活力的影響不顯著。五、 pH對葡萄糖氧化酶作用的影響 葡萄糖氧化酶的活性在pH4.5pH7.0之間保持良好的穩(wěn)定性。pH大于7.0或小于4.5酶將迅速失活。 酶的底物起著穩(wěn)定酶的作用，例如，在

8、pH8.1和不存在葡萄糖的條件下，10分鐘內(nèi)酶活力損失90%；而在相同pH和存在葡萄糖的條件下，40分鐘內(nèi)酶活力僅損失20%。 在實際工作中的特定環(huán)境下，低pH時也可以使用葡萄糖氧化酶。例如，30時的霉菌葡萄糖氧化酶制劑在pH2.6條件下的可樂飲料和pH3.2的葡萄飲料中仍具有較高的穩(wěn)定性。盡管在該環(huán)境下葡萄糖氧化酶的反應速度較慢，但它仍能起到催化作用。六、 葡萄糖氧化酶的抑制劑 葡萄糖氧化酶的抑制劑為Hg2+、Ag+、對氯代汞基苯甲酸、苯基脲乙酯及肼、苯肼、亞硫酸鈉、雙甲酮等巰基螯合劑。腺嘌呤二核苷酸（FAD）對其結構有穩(wěn)定作用。 甘露糖、果糖以及D-阿拉伯糖對葡萄糖氧化酶有比較明顯的競爭性

9、抑制作用，因此不宜與其共同使用。 氰化物和一氧化碳對酶沒有抑制作用。七、葡萄糖氧化酶測定原理 氧存在情況下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化反應，形成D-葡萄糖酸，反應時吸收了氧，釋放出過氧化氫，加過氧化氫酶后分解過氧化氫，產(chǎn)生的氧又將鄰聯(lián)二茴香胺氧化，變成一種棕色物質(zhì)，在436nm436nm下有最大吸收，與酶活性成正比。根據(jù)吸光度和標準值可計算出酶的活力。八、葡萄糖氧化酶在食品加工中的應用 葡萄糖氧化酶的作用歸納起來不外乎四個方面：一是去葡萄糖，二是脫氧，三是殺菌，四是測定葡萄糖含量。1、 蛋類食品的脫糖保鮮 葡萄糖氧化酶最重要的應用之一就是防止美拉德反應。 由于蛋清中含有0.5%0.6%的葡萄

10、糖，因此在蛋類制品加工和貯藏過程中，極易發(fā)生葡萄糖分子中的羰基與蛋白質(zhì)分子的氨基結合生成黑蛋白的美拉德反應。 美拉德反應不但導致食品中葡萄糖和游離氨基消失，還會使食品褐變、營養(yǎng)損失，風味也會發(fā)生變化，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。因此，在蛋制品加工過程中往往要先進行蛋清的脫糖處理，以防止食品因氧化而引起的品質(zhì)下降和變質(zhì)。 早期在蛋制品工藝中多是采用干或濕酵母發(fā)酵的方法除去葡萄糖，該方法的缺點是周期長，衛(wèi)生條件差，產(chǎn)品質(zhì)量也不理想。近幾年來，在干制蛋品加工中已普遍采用葡萄糖氧化酶進行脫糖處理。 用葡萄糖氧化酶過氧化氫酶體系將還原糖分子上的醛基轉(zhuǎn)變成羧基醛基轉(zhuǎn)變成羧基，這樣就消除了美拉德反應中的產(chǎn)物之一還原糖

11、。反應中需要不斷地供給氧氣，因此使用葡萄糖氧化酶脫糖時應分次加入適量的H2O2溶液，這樣同葡萄糖氧化酶一起使用的過氧化氫酶就能分解H2O2，以補充反應所需要的氧。 另外，適當降低反應溫度可以保持乳狀液的穩(wěn)定性，且由于溫度降低后氧在蛋品中的溶解度提高，酶反應速度不受影響。因此，目前食品工業(yè)優(yōu)先選擇在低溫下完成蛋品的脫糖操作。 采用葡萄糖氧化酶脫糖后的蛋制品基本上不會發(fā)生褐變。另外，脫糖處理后蛋清可保持原有色澤，且蛋腥味消失，起泡性和起泡穩(wěn)定性均有明顯提高，凝膠強度也有所增加。優(yōu)良的起泡性和高凝膠性是蛋清的重要功能性質(zhì)，在食品工業(yè)上有廣泛應用，因此葡萄糖氧化酶脫糖法還有助于提高產(chǎn)品的實用價值。因此

12、相對于其他脫糖方法而言，這也是葡萄糖氧化酶法脫糖的優(yōu)點之一。2、 防止食品氧化 食品在運輸貯藏保存過程中，由于氧的作用，容易發(fā)生一系列不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學反應，引起色、香、味的改變。 例如，氧的存在容易引起花生、奶粉、餅干、油炸食品等富含油脂的食品發(fā)生氧化作用，引起油脂酸敗，產(chǎn)生不良風味而造成食品營養(yǎng)損失、變質(zhì)。 氧化也會引起去皮果蔬、果醬以及肉類發(fā)生褐變。 另外氧的存在也為許多微生物生長創(chuàng)造了條件，導致食品風味品質(zhì)下降。 解決氧化問題的根本辦法是脫氧。 葡萄糖氧化酶是一種理想的除氧保鮮劑，可有效防止食品因氧化而引起的質(zhì)量下降和變質(zhì)。 罐藏食品可以使用含葡萄糖氧化酶的吸氧保鮮袋防止氧化，罐裝果

13、汁、酒和水果罐頭等可以直接加入葡萄糖氧化酶以保持品質(zhì)，另外葡萄糖氧化酶也可以有效地防止罐裝容器的氧化作用。 脫氧方法具體應用如下：（1）干鮮食品脫氧瓶裝或罐裝的干鮮食品貯藏時，因容器密封性差，所以有必要除去氧。可以在容器中放入含葡萄糖氧化酶及其作用底物葡萄糖的吸氧保鮮袋，這樣容器中的氧氣透過薄膜進入袋中就在葡萄糖氧化酶作用下與葡萄糖反應，從而達到脫氧的目的。（2）酒類脫氧啤酒中含氧過高易引起啤酒的氧化，產(chǎn)生老化味，嚴重影響啤酒質(zhì)量。利用葡萄糖氧化酶復合體系，可以有效地去除啤酒中的溶氧，在啤酒加工過程中以及包裝后的貯藏中起到保護作用。 葡萄糖氧化酶用于啤酒脫氧時的使用量為每升啤酒中加 1070個

14、單位，添加時機以發(fā)酵后啤酒與酵母剛剛分離時較為理想。 但是，盡管利用葡萄糖氧化酶可以有效地去除溶氧，啤酒風味的穩(wěn)定性并沒有得到很好的改善，因此近幾年來葡萄糖氧化酶在啤酒脫氧方面應用的研究進展不大。 氧的存在給白葡萄酒的生產(chǎn)造成極大的困難，葡萄皮、葡萄梗和葡萄籽中含有較高的多酚氧化酶和酚類物質(zhì)，會使白葡萄酒發(fā)生褐變，尤其是使用原料的成熟度較差或以霉變的葡萄為原料釀制白葡萄酒，問題更為嚴重。 如在生產(chǎn)過程中添加濃度為2040單位/L酒的葡萄糖氧化酶，便可以有效地減輕氧造成的危害。 另外，當葡萄糖氧化酶應用于葡萄酒脫氧時，添加適量的葡萄糖可在一定程度上加快氧氣消除的速度。 白葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶

15、能夠防止葡萄酒發(fā)生酶褐變和口感、味覺的變化，還可以防止色素的沉淀，延長保存期。（3）飲料脫氧保鮮果汁在深加工過程中若發(fā)生氧化作用，其中的一些不飽和成分如不飽合脂肪酸和烯二醇類物質(zhì)將會分解，使果汁品質(zhì)低下。尤其是Vc等維生素類的物質(zhì)的氧化會使營養(yǎng)大量流失。添加葡萄糖1g/L，葡萄糖氧化酶20mg/L即可有效防止氧化的發(fā)生。 含有果汁或天然油的所有柑橘類軟飲料風味物質(zhì)都容易逸失，光照后還會產(chǎn)生日光臭，降低飲料的品質(zhì)和貨架期。采用葡萄糖氧化酶除氧劑可以保持柑橘飲料的新鮮色澤風味。 該方法對于無果汁飲料也同樣有效，實驗證明葡萄糖氧化酶在軟飲料中起到保持正常口味、防止飲料氧化褪色、除殘氧后降低飲料中氧化

16、的鐵質(zhì)等作用。（4）蝦肉食品保鮮由于蝦類固有的生物和生物化學特性（含水77%，蛋白質(zhì)20.6%），使得其在加工儲藏、運輸、及銷售過程中很容易腐敗變質(zhì)，嚴重影響它的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值。傳統(tǒng)的新鮮蝦類保鮮方法是采用低溫保存，但由于蝦類自身存在的多酚氧化酶在蝦類冷凍、冰藏和解凍期間仍然保持著活性，致使蝦類食品都難以避免地發(fā)生褐變，因此對蝦類保鮮來說防褐變是非常重要的。 如果將蝦肉置于葡萄糖氧化酶過氧化氫酶溶液中浸泡，或?qū)⒚敢杭尤氲桨b的鹽水中，就能有效阻滯蝦肉顏色的改變和防止蛤敗的產(chǎn)生。采用葡萄糖氧化酶保鮮的蝦肉食品，冷藏、凍藏都能保持二級鮮度，色澤、氣味和彈性保持良好。葡萄糖氧化酶在蝦、蟹肉等食品

17、保鮮方面的應用有很好的發(fā)展前途。（5）穩(wěn)定食品乳狀液的質(zhì)量油水乳化后的食品乳狀液如蛋黃醬，由于在加工過程中引入了約占總體積1020%的空氣，盡管在控制金屬離子污染上作了很大的努力，并且使用了螯合劑，然而貨架壽命仍然因為受包藏的氧的作用而顯著縮短。保藏期間的質(zhì)量下降主要表現(xiàn)為顏色減褪和蛤敗，并失去乳化性。在包裝蛋黃醬的密閉容器中適量添加葡萄糖氧化酶過氧化氫酶體系以防止其在貯藏期間的變質(zhì)，在之后6個月的保藏期內(nèi)，通過感官評定和測定過氧化值來比較經(jīng)處理的蛋黃醬和對照試樣的質(zhì)量穩(wěn)定性，可以得出以下的結論：酶處理的效果顯著，而且酶催化反應中生成的葡萄糖酸對于蛋黃醬的風味沒有不良的影響。葡萄糖氧化酶過氧化

18、氫酶處理對蛋黃醬穩(wěn)定性的影響保藏期（月）保藏期（月）感官評定感官評定顏色顏色氧化值（氧化值（mmol/kgmmol/kg樣品）樣品）對照對照酶處理酶處理對照對照酶處理酶處理對照對照酶處理酶處理0 0+ + + + +0.20.20.20.22 2+ + + + +3 3- -+ + + +6.26.20.20.24 4- -+ +- -+ +5 5- -+ +- -+ +6 60 0+ +0 0+ +14.614.60.80.8（6）防止馬口鐵罐壁氧化腐蝕罐頭生產(chǎn)雖然采用抽真空封罐，但罐頭頂隙仍有氧氣殘留，特別是酸性介質(zhì)，會腐蝕罐壁，形成氧化圈，影響罐內(nèi)食品的風味。在罐頭中應用葡萄糖氧化酶，可以減輕和防止氧化圈和罐內(nèi)的溶錫。在罐裝啤酒的情況下，也能減少馬口鐵罐壁的氧化腐蝕和鐵錫等重金屬離子的溶出，保持其原有風味。3、 殺菌 由于葡萄糖氧化酶能去除氧，所以能防止好氣菌的生長繁殖；同時由于產(chǎn)生過氧化氫，也可起到殺菌的作用。因此葡萄糖氧化酶可用于在特殊情況下防止微生物的繁殖。4、 葡萄糖氧化酶在食品分析中的作用 因葡萄糖氧化酶能專一氧化葡萄糖，故可用于定量測定各種食品中的葡萄糖含量。 目前利用固定化技術制成的葡萄糖氧化酶分析儀器已廣泛應用于發(fā)酵行業(yè)發(fā)酵液中殘?zhí)牵ㄖ饕瞧咸?/p>