1、課題課題1 DNA1 DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定一一. .基礎知識基礎知識DNADNA粗提取的基本思路：粗提取的基本思路：利用利用DNADNA與與RNARNA、蛋白質和脂、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的質等在物理和化學性質方面的差異差異，提取，提取DNADNA，去除，去除其他成分。其他成分。1.1.提取生物大分子的基本思路：提取生物大分子的基本思路：選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。學性質的生物大分子。2.DNA2.DNA的理化特性的理化特性1)DNA1)DNA的溶解性的溶解性在在NaClNaCl溶液濃度在

2、溶液濃度在0.14 mol/L0.14 mol/L時時,DNA,DNA溶解度溶解度最小最小；低于低于( (或高于或高于)0.14 mol/L)0.14 mol/L時，時，DNADNA的溶解度隨的溶解度隨NaClNaCl溶溶液濃度的降低液濃度的降低( (或增加或增加) )而逐漸增大。而逐漸增大。DNADNA的的不溶于不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精酒精，某些蛋白質溶于酒精2)DNA2)DNA的其它特性的其它特性蛋白酶能水解蛋白質，但是對蛋白酶能水解蛋白質，但是對DNADNA沒有影響沒有影響大多數蛋白質不能忍受大多數蛋白質不能忍受60608080的高溫，而的高溫，而DNADNA在在8080以上才會變

3、性以上才會變性洗滌劑洗滌劑可以可以瓦解瓦解細胞的細胞的細胞膜細胞膜，但對，但對DNADNA沒有影響沒有影響3.DNA3.DNA的鑒定原理的鑒定原理1)DNA 1)DNA 二苯胺二苯胺試劑試劑沸水浴沸水浴溶液變溶液變藍色藍色2)DNA2)DNA可被可被甲基綠甲基綠染成染成綠色綠色一一) )實驗原理實驗原理二二. .實驗設計實驗設計1.1.破碎細胞，釋放核物質破碎細胞，釋放核物質動物細胞動物細胞 加加蒸餾水蒸餾水讓細胞吸水讓細胞吸水脹破脹破, ,過濾得濾液過濾得濾液植物細胞植物細胞 加洗滌劑和食鹽加洗滌劑和食鹽, ,充分研磨充分研磨 蒸餾水對于雞血細胞來說是蒸餾水對于雞血細胞來說是低滲溶液低滲溶液

4、, ,水分可大量進水分可大量進入雞血細胞入雞血細胞, ,是細胞是細胞脹裂脹裂, ,從而從而釋放釋放DNADNA攪拌可攪拌可加速加速細胞破裂細胞破裂討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？二二) )實驗材料的選取實驗材料的選取選選DNADNA含量較高含量較高的生物組織作為材料的生物組織作為材料, ,成功可能性更大成功可能性更大材料：可選魚卵、豬肝、雞血材料：可選魚卵、豬肝、雞血2.2.除去雜質，分離出除去雜質，分離出DNADNA 用濃度為用濃度為2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNA,DNA,逐漸加水稀釋逐漸加水稀釋, ,當降至

5、當降至0.14mol0.14molL L時時( (溶解度最低溶解度最低) )可以使可以使DNADNA析出析出向向DNADNA的鹽溶液，逐漸加的鹽溶液，逐漸加酒精酒精，可，可析出析出DNADNA三三) ) 實驗步驟實驗步驟1 1雞血加入檸檬酸鈉溶液液，是為了防止血液凝固。雞血加入檸檬酸鈉溶液液，是為了防止血液凝固。三三) ) 實驗步驟實驗步驟三三) ) 實驗步驟實驗步驟三三) ) 實驗步驟實驗步驟7.DNA7.DNA的鑒定：取兩支試管，各加入的鑒定：取兩支試管，各加入2ml0.0152ml0.015氯化鈉溶氯化鈉溶液，將液，將DNADNA溶解于其中一支試管中，另一支做為對照組。溶解于其中一支試管

6、中，另一支做為對照組。然后，在兩支試管內加等量的二苯胺試劑，水浴加熱然后，在兩支試管內加等量的二苯胺試劑，水浴加熱10min10min左右，冷卻，觀察實驗現象。左右，冷卻，觀察實驗現象。例例1.1.下列關于下列關于DNADNA的敘述正確的是的敘述正確的是( ( ）A.A.隨著氯化鈉溶液濃度增大，隨著氯化鈉溶液濃度增大，DNADNA在氯化鈉溶液中的溶在氯化鈉溶液中的溶解度也增大解度也增大B.B.隨著氯化鈉溶液濃度的減小，隨著氯化鈉溶液濃度的減小，DNADNA在氯化鈉溶液中的在氯化鈉溶液中的溶解度也減小溶解度也減小C.DNAC.DNA不溶于酒精，也不溶于不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L0.1

7、4mol/L的氯化鈉溶液的氯化鈉溶液D.DNAD.DNA與二苯胺試劑在沸水中加熱，溶液變藍色與二苯胺試劑在沸水中加熱，溶液變藍色D D例例2.2.雞血中含大量紅細胞，實驗室常用雞血提取雞血中含大量紅細胞，實驗室常用雞血提取DNADNA。根據根據DNADNA提取實驗，完成下列各題。提取實驗，完成下列各題。1.1.為了防止雞血凝血需加入的試劑是為了防止雞血凝血需加入的試劑是 。2.2.將雞血離心，取下層，除去上清的目的是將雞血離心，取下層，除去上清的目的是3.3.向向DNADNA的氯化鈉溶液緩緩加蒸餾水，直至析出的氯化鈉溶液緩緩加蒸餾水，直至析出DNADNA不再不再增加，此時氯化鈉溶液的濃度約為增

8、加，此時氯化鈉溶液的濃度約為 . .檸檬酸鈉檸檬酸鈉去雜質去雜質0.14mol/L0.14mol/L4.4.若沒雞血，能否用牛羊血代替？為什么？若沒雞血，能否用牛羊血代替？為什么？5.5.若用菜花進行提取若用菜花進行提取, ,需加入需加入 , ,并充分研磨并充分研磨洗滌劑和洗滌劑和食鹽食鹽課題課題2 2 多聚酶鏈式反應擴增多聚酶鏈式反應擴增DNADNA片段片段（PCRPCR）一、基礎知識一、基礎知識一一)PCR)PCR原理原理 PCR PCR是一種在是一種在體外體外快速擴增快速擴增特定基因或特定基因或DNADNA片段片段的技術，它能以極少量的的技術，它能以極少量的DNADNA為模板，在幾小時內

9、為模板，在幾小時內復制出上百萬份的復制出上百萬份的DNADNA拷貝。拷貝。1.PCR1.PCR的反應條件的反應條件一定的緩沖溶液一定的緩沖溶液-維持維持pHpH；DNADNA模板；模板；分別與兩條模板鏈相結合的分別與兩條模板鏈相結合的兩種兩種引物；引物；四種脫氧核苷酸；四種脫氧核苷酸； 耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶；聚合酶； 控制溫度控制溫度因此，因此，DNADNA復制方向：只能從子鏈的復制方向：只能從子鏈的55端到端到33端端延延伸伸2.DNA2.DNA復制的方向復制的方向 DNA DNA聚合酶聚合酶不能從頭開始不能從頭開始合成合成DNADNA，只能只能將將核苷酸連接到核苷酸連接到DNAD

10、NA片段的片段的33端端。引物引物 能與母鏈的一段堿基序列互補配對的一小段能與母鏈的一段堿基序列互補配對的一小段單鏈單鏈DNADNA片段或片段或RNARNA且需要且需要引物引物(20(203030個核苷酸個核苷酸) )PCRPCR技術通過技術通過控制溫度控制溫度來控制雙鏈的解旋與結合來控制雙鏈的解旋與結合 DNA DNA在在8080100100時雙螺旋結構將解體時雙螺旋結構將解體, ,雙鏈分開雙鏈分開; ;當當溫度降低溫度降低后雙鏈又能重新結合成雙螺旋結構后雙鏈又能重新結合成雙螺旋結構因此因此,PCR,PCR過程過程無需無需解旋酶解旋酶, ,但需但需耐高溫耐高溫的的DNADNA聚合酶聚合酶3.

11、DNA3.DNA的熱變性原理的熱變性原理二二)PCR)PCR的反應過程的反應過程1.1.變性：變性：2.2.復性：復性：3.3.延伸：延伸：循環循環升高溫度到升高溫度到90900 0C C以上以上DNADNA解聚為單鏈解聚為單鏈溫度降到溫度降到50500 0C C左右左右兩種引物與兩條單鏈兩種引物與兩條單鏈DNADNA結合結合升溫度升到升溫度升到70700 0C C左右左右在在DNADNA聚合酶的作用下用溶液中的脫氧核苷酸聚合酶的作用下用溶液中的脫氧核苷酸根據堿基互補配對原則合成新根據堿基互補配對原則合成新DNADNA鏈鏈一一) )實驗操作步驟實驗操作步驟準備好準備好PCRPCR反應體系的配方

12、反應體系的配方用微量移液器按配方在往微量用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分離心管中加入各組分蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應液蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應液離心離心10S10S將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上儀上, ,設置設置好循環程序進行反應好循環程序進行反應二、實驗操作二、實驗操作二二) )操作提示操作提示PCRPCR技術技術高度靈敏，高度靈敏，為了避免外源為了避免外源DNADNA等因素的污等因素的污染而造成干擾實驗，染而造成干擾實驗，PCRPCR操作時要注意做到：操作時要注意做到：隔離操作區，所用微量離心管、槍頭、緩沖液隔離操作區，所用微量離心管、槍頭、緩沖

13、液以及蒸餾水等在使用必須進行以及蒸餾水等在使用必須進行高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌；所用試劑在所用試劑在-20-20保存保存，使用時，放在，使用時，放在冰塊冰塊上上慢慢融化。慢慢融化。分裝試劑，簡化操作程序，使用分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭。一次性槍頭。1 1 、測定的、測定的原理原理 可以通過計算可以通過計算DNADNA含量來評價擴增的效果，含量來評價擴增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與峰值的大小與DNADNA的含量有關。的含量有關。2 2 、過程過程稀釋：稀釋：2uLPCR2uLPCR反應液，加入反應

14、液，加入98uL98uL蒸餾水，即將樣蒸餾水，即將樣品進行品進行5050倍稀釋。倍稀釋。對照調零對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm260nm處，處，將紫外分光光度計的讀數調節至零。將紫外分光光度計的讀數調節至零。取取DNADNA稀釋液稀釋液100uL100uL至比色杯中，測定至比色杯中，測定260nm260nm處處的光吸收值的光吸收值比色比色計算計算DNADNA含量含量( ( g/mLg/mL) )50 x(260nm50 x(260nm的讀數的讀數)x )x 稀釋倍數稀釋倍數5050：1 1 g g/mL/mL的的DNADNA在厚度為在厚度為1cm1c

15、m比色杯中的吸光值為比色杯中的吸光值為0.020.02課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離基礎知識基礎知識一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法 根據被分離物質的蛋白質根據被分離物質的蛋白質相對分子質量相對分子質量的大小，的大小，來進行分離。來進行分離。1.1.概念：概念：思路思路利用不同蛋白質分子的特性利用不同蛋白質分子的特性( (形狀、大小、形狀、大小、帶電情況等帶電情況等) )差異，分離不同種類的蛋白質差異，分離不同種類的蛋白質課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離基礎知識基礎知識一一) )凝膠色譜法凝

16、膠色譜法2.2.原理：原理： 2 2）當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量子量較小較小的蛋白質容易的蛋白質容易進入進入凝膠凝膠內部內部的通道，路程較的通道，路程較長長，移動速度較移動速度較慢慢; ;而相對分子量而相對分子量較大較大的蛋白質無法進入的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能凝膠內部的通道，只能在在凝膠凝膠外部外部移動，路程較移動，路程較短短，移，移動速度較動速度較快快。1)1)凝膠凝膠是由多糖類化合物是由多糖類化合物( (如葡聚糖如葡聚糖) )構成的構成的多孔小球體多孔小球體，內部有許多貫穿的，內部有許多貫穿的通道通道。課題課題3 3

17、 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離基礎知識基礎知識二二) )緩沖液緩沖液 在在一定一定的范圍內，凡是能夠的范圍內，凡是能夠抵制抵制外加少量強外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液酸或強堿的影響使原來溶液PHPH值值基本保持不變基本保持不變的混的混合溶液。合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液PHPH值的影響，值的影響，維持維持PHPH基本不變。基本不變。課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作 蛋白質的提取和分離步驟：蛋白質的提取和分離步驟：1.1.樣品處理樣品處理 2.2.粗分離粗分離 3.3.純化純化 4.4.純度鑒定純度鑒定 課

18、題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作1.1.樣品處理樣品處理: : 1)1)紅細胞的紅細胞的洗滌洗滌: :目的目的: :去除雜蛋白去除雜蛋白b b低速短時間離心低速短時間離心操作操作: :a a采集血樣采集血樣d d鹽水洗滌鹽水洗滌c c吸取血漿吸取血漿上層透明的黃色血漿上層透明的黃色血漿重復重復b c db c d步驟三次步驟三次用五倍體積的質量分數為用五倍體積的質量分數為0.90.9的的NaClNaCl溶液洗滌溶液洗滌加抗凝劑檸檬酸鈉加抗凝劑檸檬酸鈉課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作1.1.樣品處理樣品處理: : 2)

19、2)血紅蛋白的釋放：血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到原血液體積加蒸餾水到原血液體積, ,再加再加4040體積的甲苯體積的甲苯, ,置于磁力攪拌器上充分攪拌置于磁力攪拌器上充分攪拌1010分鐘分鐘( (加速細胞破裂加速細胞破裂) )細胞破裂釋放出血紅蛋白。細胞破裂釋放出血紅蛋白。課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作1.1.樣品處理樣品處理: : 離心離心( (以以2000r/min,10 min)2000r/min,10 min)過濾過濾( (用濾紙用濾紙, ,除去脂溶性沉淀層除去脂溶性沉淀層) )分離分離( (用分液漏斗用分液漏斗, ,分出下層的分出下層的紅色透

20、明液體紅色透明液體) )課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作2.2.粗分離透析粗分離透析除去樣品中分子量除去樣品中分子量較小較小的雜質的雜質利用透析袋的利用透析袋的半透性半透性某些雜質分子比血紅蛋白分子某些雜質分子比血紅蛋白分子小小，可透過可透過透析袋透析袋課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作3.3.純化純化 玻璃管玻璃管底塞的制作底塞的制作頂塞的制作頂塞的制作組裝組裝安裝其他附屬結構安裝其他附屬結構用用凝膠色譜法凝膠色譜法將將分子量較大分子量較大的雜質蛋白質除去的雜質蛋白質除去課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白

21、的提取和分離實驗操作實驗操作3.3.純化純化 2)2)凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的裝填裝填注意注意:a:a凝膠裝填時盡量緊密凝膠裝填時盡量緊密, ,以降低凝膠顆粒之間的空隙以降低凝膠顆粒之間的空隙 b b裝填凝膠柱時不得有氣泡存在裝填凝膠柱時不得有氣泡存在課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作3.3.純化純化 2)2)凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的裝填裝填凝膠的選擇凝膠的選擇凝膠的前處理凝膠的前處理凝膠色譜柱的裝填方法凝膠色譜柱的裝填方法注意注意:a:a凝膠裝填時盡量緊密凝膠裝填時盡量緊密, ,以降低凝膠顆粒之間的空隙以降低凝膠顆粒之間的空隙 b b裝填凝膠柱時不得有氣

22、泡存在裝填凝膠柱時不得有氣泡存在洗滌平衡洗滌平衡a a液面不要低于凝膠表面，液面不要低于凝膠表面， b b不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象3.樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫 1.調液面調液面 2.加樣加樣 3.再調液面再調液面 4.洗脫洗脫 5.收集收集緩沖液緩沖液凝膠凝膠課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作3.3.純化純化 3)3)樣品加入與洗脫樣品加入與洗脫 注意：注意：a a不要觸及并破壞凝膠面。不要觸及并破壞凝膠面。b b貼壁加樣。貼壁加樣。 c c使吸管管口沿管壁環繞移動。使吸管管口沿管壁環繞移動。課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離實驗操作實驗操作4.4.純度鑒定純度鑒定 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳鑒定血紅蛋白鑒定血紅蛋白純度純度。略略課題課題3 3 血紅蛋白的提取