1、羅氏診斷二代測序技術羅氏診斷二代測序技術在在HBVHBV耐藥檢測耐藥檢測中的中的應應用用 羅氏診斷羅氏診斷 應用科學應用科學市場部市場部 劉璐璐劉璐璐HBV HBV 耐藥性產(chǎn)生耐藥性產(chǎn)生 病毒每天高速復制，并在復制時發(fā)生錯誤，這些自發(fā)突變導致突變株出現(xiàn)。 突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。 但在病毒藥物作用下，藥物對于耐藥性的突變有選擇作用，導致了耐藥菌株成為優(yōu)勢株，導致藥物治療的失敗。 耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測的意義耐藥檢測的意義治療前檢測，有助于臨床判斷用治療前檢測，有助于臨床判斷用藥是否有效；藥是否有效；治療中每治療中每 36個月檢

2、測，有助于個月檢測，有助于觀察療效，及時調整用藥觀察療效，及時調整用藥EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.用藥后出現(xiàn)耐藥用藥后出現(xiàn)耐藥拉米夫定拉米夫定 阿德福韋酯阿德福韋酯 恩替卡韋恩替卡韋 替比夫定替比夫定 替諾福韋替諾福韋測序用于病毒耐藥檢測測序用于病毒耐藥檢測深度測序可檢出低頻準種深度測序可檢出低頻準種超深焦磷酸測序可檢測低于1%的準

3、種普通焦磷酸測序僅限5%及以上的準種毛細管電泳測序僅限20%及以上的準種提早判斷準種組成，在劣勢菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢菌種之前，即調整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對身體傷害。454454高深度測序優(yōu)勢高深度測序優(yōu)勢已經(jīng)成功實現(xiàn)對于RTRT基因區(qū)段基因區(qū)段1%1%突變位點的發(fā)現(xiàn)突變位點的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測序及線性探針反向雜交法更加靈敏更加靈敏進行相對定量定量，對于病毒群體中突變數(shù)量改變進行跟蹤深度測序的運用將較傳統(tǒng)方法提前提前3-63-6個月檢測出突變個月檢測出突變，因此能夠更好的抓住治療的時機并給出治療的方案454454測序系統(tǒng)發(fā)展測序系統(tǒng)發(fā)展測序通量及讀長不斷增加，大小測序平臺齊備

4、GS 20 GS 20 GS FLX Standard GS FLX Standard20 Mb20 Mb100 Mb100 Mb200520052007200720082008FutureFutureEven Longer ReadsEven Longer ReadsHigher DensityHigher DensityLaterLater GS FLX Titanium GS FLX Titanium500 Mb500 MbGS Junior TitaniumGS Junior Titanium GS GS FLX+FLX+20112011獨立獨立實驗室適用型實驗室適用型精巧精巧型型 二

5、代測序平臺二代測序平臺 GS JuniorGS JuniorGS Junior GS Junior 測序步驟概覽測序步驟概覽Mix ssDNA & capture beads 454 454 測序流程測序流程 文庫構建文庫構建1. 4541. 454文庫構建：文庫構建：Shotgun Shotgun Paired-endPaired-end300bp1Kb, 3Kb, 300bp1Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb8Kb, 20Kb* *PCRPCR產(chǎn)物可直接測序產(chǎn)物可直接測序傳統(tǒng)文庫構建：傳統(tǒng)文庫構建：BACBAC克隆克隆-Shotgun/PCR-Shotgun/PCR一個片段一個

6、片段 = = 一個反應珠一個反應珠 454 454 測序流程測序流程 emPCR2. 2. emPCRemPCR每個每個DNADNA分子分子獨立獨立進行進行PCRPCR反應后反應后獨立獨立測序測序擴增效果好，適應高擴增效果好，適應高GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE樣本樣本一個反應珠一個反應珠 = 一個讀長一個讀長 單克隆測序的價值單克隆測序的價值通過通過 emPCRemPCR實現(xiàn)單克隆實現(xiàn)單克隆直接閱讀每一種分子結果直接閱讀每一種分子結果突變比例的計算（低頻）基于實際的序列信息突變比例的計算（低頻）基于實際的序列信息每個每個DNADNA分子分子獨立獨立進行進行PCRPCR反

7、應后反應后獨立獨立測序測序擴增效果好，適應高擴增效果好，適應高 GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE樣本樣本Sanger 流程-混合測序454 流程-單克隆測序454454測序流程測序流程 測序測序1. 特異的測序引物和單鏈DNA模板結合, 加入一種dNTP2. DNA DNA 聚合酶聚合酶的作用下，單個 dNTP與模板的下一個堿基配對，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)3. 在ATPATP硫酸化酶硫酸化酶的作用下，PPi和APS結合形成ATP4.在熒光素酶熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉5.5. ApyraseAp

8、yrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP6.加入另一種dNTP重復2-5步驟7.在每一個測序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlatePicoTiterPlate板8.當模板鏈的互補核苷酸加入延伸鏈時，會產(chǎn)生了熒光信號9.熒光信號強度與所加入的核苷酸數(shù)目成比例10. 熒光信號被CCD照相機記錄熒光素酶熒光素酶ATP ATP 硫酸化酶硫酸化酶氧化熒光素氧化熒光素可見光可見光3. 3. 基于焦磷酸反應的基于焦磷酸反應的邊合成邊邊合成邊測序測序13Sequencing By Synthesis A A T C G G C A T G C T A A A A G T C

9、 ACTARepeated dNTP flow sequence:GGTCAG TCA G TTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnneal PrimerProcess continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.邊合成邊測序邊合成邊測序 實驗體系的不斷優(yōu)化使得當前可獲得實驗體系的不斷優(yōu)化使得當前可獲得Junior Junior 平均為平均為400bp400bp的讀長的讀長并將繼續(xù)以提升讀長為技術的發(fā)展方向之一并將繼續(xù)以提升讀長為技術的發(fā)展方向之一454454測序流程測序流程 數(shù)據(jù)

10、獲取數(shù)據(jù)獲取圖像處理圖像處理信號處理信號處理454454測序測序流程流程數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析測序與分析同時進行，10小時完成10小時產(chǎn)出 10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應用需求軟件自動過濾，高質量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的準確性GS JuniorGS Junior在德國大腸桿菌事件中在德國大腸桿菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of Performance comparison of benchtopbenchtop high-throughput sequencing platforms high-

11、throughput sequencing platforms, Nature Biotechnology, 2012 DOI: 10.1038/nbt.2198454 GS Junior擁有最長的讀長，平均讀長在522個堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測序與機制確認工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團隊，不到半天時間即得到結果序列讀長分布圖序列讀長分布圖 Junior 測序系統(tǒng)運行產(chǎn)生的讀長范圍為50-600bp，甚至更長 shot gun實驗將利用幾乎全部數(shù)據(jù) 平均讀長平均讀長為400bp 典型讀長典型讀長在 450-550bp范圍 Amplion 實

12、驗將主要根據(jù)典型讀長進行PCR引物設計Number of readsReadlength (bases)Simple Simple simplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex Complex 454 long reads454 long readsShort read technologyShort read technology? ? ? ? ? ?454 454 長測序能夠帶來什么長測序能夠帶來什么emPCR emPCR 保證樣本的獲得，長焦磷酸確保

13、閱讀保證樣本的獲得，長焦磷酸確保閱讀長讀長的價值長讀長的價值 一條reads通讀一個目標序列，無需拼接，避免錯誤產(chǎn)生與時間消耗 通過一條reads判斷突變的連鎖關系 更少引物獲得更多目標 引物設計的區(qū)間更靈活Junior1條reads 既可通讀HBV耐藥相關基因的PCR產(chǎn)物HBVHBV耐藥耐藥RTRT基因基因(1032nt)(1032nt)檢測有檢測有overlapoverlap的的4 4個片段個片段Fragment1Fragment1(372 nt)(372 nt)9 9Fragment2(401 nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314 nt)9The Jour

14、nal of Infectious Disease, The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85. PCRPCR擴增子文庫的設計擴增子文庫的設計長讀長給予更多引物設計空間，長讀長給予更多引物設計空間，1 1條條readsreads通讀熱點突變區(qū)域通讀熱點突變區(qū)域454 B B-primer (19 bp)Locus specific PCR amplificationemPCR & 雙向測序Target specific sequence (ca. 25 bp)454 A A-primer (19 bp)A

15、AB BSequence of interest200 400 bp200 400 bp通過MID序列，可以混合多個樣本測序同時測序Data analysisRT基因可設計3個PCR產(chǎn)物片段S基因可設計2個PCR產(chǎn)物片段C基因可設計1個PCR產(chǎn)物片段X基因可設計1個PCR產(chǎn)物片段Pre-C基因可設計1個PCR產(chǎn)物片段454454測序在測序在HBV HBV 耐藥基因耐藥基因測序測序的的應用方案應用方案Day1 DNA 提取Day1 PCR產(chǎn)物的獲取Day1 PCR產(chǎn)物純化Day1 PCR產(chǎn)物樣品定量(Agilent2100, qPCR儀)Day1 PCR產(chǎn)物樣品均一化Day1 PCR產(chǎn)物混樣 D

16、ay1 454測序建庫加接頭(10min)Day2 emPCR擴增(2h手工操作+6h機器運行)Day3 454 Junior測序(10h)Day4 數(shù)據(jù)分析454 454 測序測序步驟步驟HBV耐藥檢測應用 emPCR(乳滴PCR)擴增 每一帶有MID與測序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳滴中進行獨立擴增，排除了其它競爭性或污染性序列對 PCR反應的影響。 焦磷酸測序 將所有結合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進行測序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。 將PTP板置于GS測序儀中，單個核苷酸依次流經(jīng)孔洞和DNA捕獲磁珠間。當所加入的核苷酸與

17、模板互補時，便產(chǎn)生化學發(fā)光信號，進而被GS系統(tǒng)的CCD相機記錄。454454的分析結果呈現(xiàn)的分析結果呈現(xiàn)可檢測單點突變454454的分析結果呈現(xiàn)的分析結果呈現(xiàn)可關注已知突變Multiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI ResistanceNRTI ResistanceT69ConfidentialMultiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon A

18、ssociated with NRTI ResistanceNRTI ResistanceThr69 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% SerineConfidential454454的分析結果呈現(xiàn)的分析結果呈現(xiàn)可檢測有意義的連鎖突變位點已有已有RTRT基因突變數(shù)據(jù)庫基因突變數(shù)據(jù)庫StandfordStandford HBVSeqHBVSStandfordStandford HBVSeqHBVSeq結果展示結果展示近兩年使用近兩年使用454 454 發(fā)表發(fā)表HBVHBV耐藥檢測文獻耐藥檢測文獻Analysis of hepatitis B virus

19、drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencingpyrosequencing. . Ko SY, Oh HB, Park CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep Ultra-deep pyrosequencingpyrosequencing detects conserved ge

20、nomic sites and quantifies linkage of detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant drug-resistant amino Acid amino Acid changes in the hepatitis B virus changes in the hepatitis B virus genome. genome. Rodriguez-Fras F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domingo E

21、, Cubero M, Cams S, Ferrer-Costa C, Snchez A, Jard R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencingpyrosequencing in a chronic in a chronic hepatitis B hepatitis B virus (HBVvirus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy )-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard G, Vazquez M